【摘要】 目的 探讨血管内皮生长因子(VEGF)在实体肿瘤中的作用。化学反应工程原理方法 应用分子克隆技术构建人全长VEGFcDNA反义基因真核表达载体，并用脂质体法转入人肝癌细胞系(HepG2)，观察转染后肝癌细胞在裸鼠体内的生长及瘤体内微血管的通透性。结果 各组细胞在裸鼠体内的成瘤时间无明显差别，但反义核酸转染组肿瘤的生长速度及瘤体的重量均明显落后于其他组，肿瘤内血管的通透性也显著降低。长绒兔
结论 VEGF在实体肿瘤的生长过程中起着十分重要的作用。 【关键词】 血管内皮生长因子 癌，肝细胞 The inhibitory effect of vascular endothelial growth factor antisense gene on the growth of hepatocellular carcinoma
LIU Jikui, HAN Benli, WANG Yuzhi.
Department of Hepatobiliary Surgery, Southwest Hospital, Third Military Medical University, Chongqing 400038
【Abstract】 Objective To explore the role of vascular endothelial growth factor (VEGF) in solid tumor. Methods The VEGF antisense gene eukaron expression vector was constructed with molecular cloning, and transfected into hepatocellular carcinoma cell line (HepG2) by lipofectin technique. The growth of transfected cell line in nude mice and the vascular permeability in tumor were examined. 口袋罪Results Though the time for oncogenesis in nude mice was not different, the growth rate, the weight of the tumor and the permeability in tumor were markedly lower in transfected group than those in other groups. Conclusion VEGF might play an important role in the growth of the solid tumor; Anti-vascular is a new method in the treatment of the solid tumor.
【Key words】 Vascular endothelial growth factor Hepatocellular carcinoma
血管内皮生长因子(VEGF)与肿瘤的生长、浸润及转移间有较为密切的关系。我们将VEG
F反义基因转入高度恶性的人肝癌细胞系(HepG2)，观察下调VEGF基因的表达对肝癌细胞生长的影响，为肿瘤的抗血管提供依据。
材料和方法
并行空间 一、材料
VEGF121PUC-19为BamH1位点插入有473bp的人VEGF121cDNA的PUC-19重组质粒，由英国Choudhori R教授惠赠。PBK-CMV为全长4.5kb，包含Neor和CMV做启动子的真核细胞表达载体，为Stritagen公司产品。脂质体转染试剂盒、G418为美国Gibico公司产品。总RNA提取试剂盒、RT-PCR反转录试剂盒为Promega公司产品。反转录随机引物Oligo Dt为美国Cybersyn公司产品。Balb/c裸小鼠6周龄，均为雌性，北京放射医学研究所实验动物所提供。
二、方法
swi.t 1、真核表达载体的构建 将VEGF121cDNA从PUC19-VEGF上切下，反向克隆入PBK-CMV载体的EcoR1\,Xba1位点之间，正向克隆入Sal1\,EcoR1位点之间，分别经EcoR1/Xba1和EcoR1/Sal1双酶切鉴定阳性PBK-VEGF121(反义)和正义重组质粒。质粒提
取、纯化、DNA的酶切、回收、连接及转入感受态菌等均参照文献［1］进行。
2、转染HepG2细胞及鉴定 用脂质体法将反义和正义PBK-VEGF121重组载体转入HepG2细胞，同时转染PBK-CMV作为空载体对照，其方法参照试剂盒的操作指南进行。筛选得到G418抗性克隆(Hep-反、Hep-正、Hep-空)。提取HepG2、Hep-反、Hep-正、Hep-空细胞基因组DNA以检测质粒克隆情况，其中载体引物为通用引物T3和T7，空载体扩增长度152bp，正向连接664bp，反向连接642bp。提取细胞总RNA，并行RT-PCR，用以检测VEGFmRNA转录情况，VEGF扩增引物分别为：上游引物：5′-GATCGAGTACTACTTCAAGCC-3′、下游引物：5′-TTGTTGTGCTGTAGGAGGC-3′，扩增长度177bp，以β-actin作为内参照，扩增长度224bp。具体操作按说明书进行。
黄可龙 3、裸鼠体内成瘤及肿瘤血管通透性实验［2］ 调整各组细胞浓度为5×106个/ml，每只裸鼠北部左右两侧皮下各接种0.2ml(1×106个)，每组接种6只，每天观察肿瘤的生长情况。肿瘤血管通透性检测按文献［2］进行。
结果
1、VEGF重组载体的鉴定 正反向连接产物均用EcoR1+Sal1和EcoR1+Xba1酶切以进一
步鉴定连接产物的方向，其中正向连接被EcoR1+Sal1切出长499bp的片段，而被EcoR1+Xba1则切成线性化；反向连接则刚好相反。
2、VEGF反义和正向质粒载体转染细胞克隆的分离和鉴定 (1)克隆细胞基因组DNA中表达载体的PCR检测 3个含载体的转染组PCR产物在1%琼脂糖凝胶上均出现特异性光带，而对照组则没有。位于Marker(PBR322 Hinf I)154bp附近，空载体组出现特异性光带(152bp)，在Marker 517bp后方，正义组(664bp)和反义组(642bp)出现特异性光带，其中反义组稍靠前一些，该结果与理论值完全一致，说明表达载体已稳定转染至细胞基因组中。(2)基因组总RNA的RT-PCR扩增 在PCR Marker 237bp处附近，4组均出现特异性光带，且亮度基本一致，此为内参照标记β-actin，而在其上方出现的光带为VEGF的特异光带，其长度为177bp，其中对照组、空载体组和正义组的亮度无明显差别，而反义组则明显低于其他3组。
3、裸鼠体内致瘤能力 细胞接种于裸鼠皮下后，6天左右即可见肿瘤出现，4组间无明显差异，成瘤率100%，但瘤体的生长速度则明显不同，反义核酸组肿瘤体积明显小于其他3组，荷瘤鼠的全身情况也好。切取后的肿瘤重量中反义组(295.1±14.5)mg也明显低于其他组［对照组(427.4±15.3)mg、空载体组(434.8±7.77)mg、正义组(420.6±18.1)mg］，三组
间差异有显著性(P＜0.001)。
4、瘤体内微血管通透性 反义组瘤体内微血管的通透性(0.216±0.017)mg染料/g组织显著低于其他3组［对照组(0.334±0.022)mg染料/g组织、空载体组(0.326±0.018)mg染料/g组织、正义组(0.329±0.019)mg染料/g组织］(P＜0.001)。而该三组间无明显差异(P＞0.05)。
讨论
细胞在导入外源反义RNA表达载体后，反义RNA与靶RNA可以共存于细胞中。我们提取基因组总RNA，采用RT-PCR的方法扩增基因组中VEGF序列，结果表明，VEGF反义核酸已导入细胞基因组，且与基因组中内源性的VEGF互补， 抑制了内源性VEGFmRNA的活性。本实验结果显示，反义转染组在裸鼠体内成瘤的速度以及瘤体的重量和瘤体内微血管通透性均明显低于其他组。说明瘤体组织内部缺血严重，减少了肿瘤生长所必需的营养成分的供给，从而抑制了肿瘤的生长。肝癌细胞内VEGF的表达和分泌减少，降低了其对组织中血管内皮细胞的促分裂、生长和迁移作用，同时，也抑制了其促血管通透性增加的作用，减少了组织中血浆等基质成分的渗出，消除了血管内皮细胞及肿瘤细胞赖以存在的基础，从而达到了抑制肿瘤生长、浸润甚至向周围和远处转移的效果。
实体肿瘤的发展分为血管形成前期和血管形成期。在血管形成前期，肿瘤无诱导血管生成
的能力，且肿瘤的体积也是有限的，当超过2～3mm，它的营养不能靠原来的弥散来提供，肿瘤细胞会分泌一些血管形成因子来诱发新血管的形成，从而满足肿瘤的生长需要。当重新供给血液后，肿瘤则迅速生长。在肿瘤细胞分泌的因子中，VEGF是唯一直接作用于内皮细胞的，其在血管的形成中起极其关键的作用，其不仅促进肿瘤的生长和浸润，而且当其引起血管通透性增高的同时，也增加了肿瘤细胞进入血液循环而远处转移的机会。这也就可以解释我们的实验结果：即无论VEGF反义核酸组抑或是其他组细胞在裸鼠体内的成瘤时间无明显差别，但反义组生长速度却显著低于其他组。
作者单位：韩本立 刘吉奎 400038 重庆，第三军医大学西南医院肝胆外科中心；
王玉芝 北京放射医学研究所
参考文献
1 J萨姆布鲁克，EF佛里奇，T曼泥阿蒂斯.分子克隆实验指南.第2版.北京：科学出版社，1992.24-372.
2 刘育英.微血管通透性测定方法.见田牛主编“微循环方法学”.北京：人民军医出版社，1993.2.47-50.
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