Mar.200319(1)23～26
神经解剖学杂志
(ChineseJournalofNeuroanatomy)
大鼠脑组织中p75基因克隆及其探针制备①
刘梅丁斐顾晓松
(南通医学院生物技术系，江苏省神经再生重点实验室，南通226001) 摘要为了克隆大鼠p75基因并制备标记的p75cDNA探针(digp75cDNA)，本研究采用RT—PCR法，从大鼠脑组织 mRNA中扩增p75基因mRNA部分片段，克隆入T载体，并经序列测定.以dig—p75cDNA为探针，采用原位杂交方法观察成年
SD大鼠海马组织中p75mRNA的表达.结果:RTPCR法扩增出一种特异产物与预期长度386bp相符,T载体克隆测序与p75
基因100同源.原位杂交结果显示，阳性信号出现在成年大鼠海马组织中.结论：采用RTPCR和T载体技术获得了.大鼠脑组
织p75基因克隆,dig—p75cDNA探针原位杂交显示正常SD大鼠海马组织中表达p75mRNA.
关键词p75基因T—A克隆标记原位杂交大鼠GENECLONINGOFp75FROMRA TBRAINANDITSPROBELABELE D
LiuMei,DingFei,GuXiaosong (DepartmentofBiotechnology,theKeyLaboratoryofNerveRegeneration ofJiangsuProvince,NantongMedicalCollege,Nantong226001) AbstractToobtainthecloneofp75fromratbrainandthenlabeledcDNAprobe bydigoxigenin,thepartialmRNAfragmentof
p75wasamplifiedbyRTPCRfromratbrain.RT—PCRproductwasligatedint opGEM—Tvector,andwassequenced.Theex
pressionofp75mRNAinhippocampusofadultratwasexaminedbyinsituhyb ridizationwithdig—p75cDNA.Theproductof
RTPCRwasthe386bpwhichmatchedthelengthexpected.Thesequenceofp7 5wascompletelyhomogene
ouswiththep75se—
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quencereported.Hybridizedsignalsofp75mRNA werefoundinhippocampu softheSDrat.Theresultsshowthatp75genecan beobtainedfromratbrainusingRT—PCRandTvectortechniques.Thestudy ofinsituhybridizationusingdigp75cDNAindi—
catesthatthep75mRNAisexpressedinhippocampusofSDrat. Keywordsp75,cloning,dig—labeled,insituhybridization,rat
神经生长因子(nervegrowthfactor,NGF)是
神经营养因子家族中第一个被发现，也是迄今为止
研究得最为清楚的一个.体内，外研究证实，它能够
促进发育中的感觉神经元及交感神经元的存活及分
化，营养成熟的神经元，维持其正常的生物学功能.
近年来的研究发现,NGF能诱导细胞凋亡，这一现
象的发现源于NGF的一个受体亚基p75的研究.
NGF受体有两种：一种是以前克隆的p75，另一种
①
是2O世纪9O年代初克隆的酪氨酸激酶受体Tr—人体名称妙喻
kA_1].最初的研究发现Trk为形成高亲和力结合位
点以及介导NGF效应所必需，而p75在NGF信号
传递中既不必要也不充分，使得p75长期以来被视
为TrkA的辅助性受体(helperreceptor).但是有的
实验发现，仅仅TrkA并不足以形成NGF高亲和力
受体，而当p75与TrkA以合适的比例共表达时，则
可观察到大量的高亲和力结合位点存在，同时p75
国家自然科学基金(No.30070255)，江苏省教育厅2000年高校科研项目(OOKJD31OO7)资助项目
通信作者：顾晓松地址：南通医学院江苏省神经再生重点实验室，南通226001，电话:0513—5504510,
E—mail:******************.jS
神经解剖学杂志第19卷第1期2003年3月
的突变可使这些位点大为减少.另有实验表明,p75
魅族m9游戏能够显着降低TrkA对NGF反应的阈值.l996年
以来对p75功能的研究取得了很大进展，认为在完
王连笑全没有TrkA的参与下,p75可以独立介导胞内信
号传递，凋控细胞凋亡l_2].由此人们对P75的研究日益深入和广泛.
本实验采用RT～PCR法，从大鼠脑组织mRNA
中扩增出p75基因mRNA部分片段，克隆人T载体.以非同位素标记物～素(digoxigenin, Dig)标记p75基因片段为探针，并经原位杂交证实. 本文为进一步研究p75mRNA的表达提供了手段. 材料和方法
1.动物与试剂
健康新生SD大鼠，由南通医学院实验动物中
心提供.
Trizol试剂，第一链eDNA合成试剂(Omnis—
cript丁MRTKit)购自Qiagen公司，还有测序试剂盒(nSequence州Kit)购自PharmaciaBiotech公司, pGEM@TEasyV ectorSystems,X—gal,IPTG购自Promega公司，标记试剂(DigDNALabeling andDetectionKit)购自Boehringer公司,Taq
DNA聚合酶,EcoRI等常用试剂购自上海试剂公司.均按操作说明进行实验.
2.引物合成
根据P75基因序列设计上游引物sense:
ccAGcccAcAcTTcTcTcTc，在1890～2009位点,
下游弓I物antisense:TTcTGAcA TTAAGGGccGTG, 由中科院上海植物生理研究所Beckman示范实验室合成，预计扩增片段长度386bp.
3.总RNA制备
新生鼠脑组织100mg，立即置Trizol试剂中匀
浆2min，按试剂操作说明提取总RNA，甲醛变性
胶电泳检测其完整性.采用紫外分光光度计，测定OD26o及OD280值，计算RNA含量.
4.逆转录反应
反应在PTC一1()()型热循环仪(MJ公司)上按
Kit操作步骤进行，反应总体积2Ol.在0.5mlEp—pendorf管内，加入总RNA2g,10/,mol/IOligo (dT)12182l,10×逆转录buffer2l,5mmol/I dNTPmix2l，加入逆转录酶1/,1(4U)，再加入DEPC—treatedH.O至2OI，轻混匀，稍离心，置
37C1h.93C5min灭活酶.产物在一2O保存.
5.PCR扩增
甘肃省循环经济总体规划在冰上依次加入ddH2O36/~1,10×PCRbuffer
5/,1,dNTPmix(each2mmol/L)2/,1,p75上下游引
安云霁
物sense和antisense(10/,mol/I)各2l，第一链
cDNA2l,Taqpolymerase(2U/>I)1l.轻混匀,
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