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中国艾滋病性病2021年4月第27卷第4期 Chin J AIDS STD Vol.27 No.4 Apr 2021
DOI: 10.13419/j ki.aids.2021.04.02
•论著•
吴逢英、刘夫华2，张纪元2，代晓朋u ，王福生
(1.解放军医学院，北京丨00853; 2.国家感染性疾病临床研究中心解放军总医院第五医学中心，北京100039) 摘要：目的探讨HIV-丨感染者外周血CD7P 红系细胞的特点及其与疾病进展的关系」方法通过流式细胞术 检测HIV-1感染者外周血CD71*红系细胞，分析其与HIV-1 RNA 、CD4细胞计数、CD4/CD8细胞比值的相关性。结 果人组10例健康对照（HCs)和49例HIV-1感染者，后者包括28例未接受过ART 者(TNS)和21例免疫重建成功患 者(C R s )与}^组（平均值0.69%)相比,TNs 组患者CD7P 红系细胞频率明显升高（平均值2.79%)。0私组患者经 ART 后，CD71+红系细胞频率降低（平均值丨.18%)，但是未恢复到正常水平。TNs 组患者CD71+红系细胞频率与病毒
载量呈显著正相关（p 〇.503 4,P=0.006 3)，与CD4/CD8细胞比值呈明显负相关（厂-0.4640, A 0.0129)。与HCs (平 均值158g/L)相比,TNS 组患者外周血血红蛋白含f i 明显降低(平均值149g/L);CRs 组患者经ART 后，血红蛋内含量 升高（平均值154g/L )，并且恢复到正常水平；TNS 组患者CD71+红系细胞频率与血红蛋白含量呈明显负相关（;=-
0.462 5, P=0.013 2)。与HCs(平均值53.84%)相比,TNs 组患者CD71*红系细胞活性氧(ROS)表达水平明显升高(平
均值66.64%);(：1^组患者经ART 后，CD71+红系细胞表达ROS 显著降低（平均值43.82%)，并且降至正常水平.结 论
HIV-1感染导致外周血CD71+红系细胞频率升高，并且与疾病进展和血红蛋内的降低密切相关。
关键词：1型艾滋病病毒；CD71•红系细胞；疾病进展；血红蛋白；活性氧 中图分类号：R 373.9
文献标志码：A
文章编号：1672-5662(2021 )04-0332-05
Characteristics and clinical significance of increased CD71 erythroid cells in peripheral blood of people living with
HIV-1 WU Fengying', LIU Fuhua2, ZHANG Jiyuan2, DAI Xiaopeng'2, WANG Fusheng'2. (/. Medical School of Chinese PLA, Beijing, 100853, China; 2. National Clinical Research Center for Infectious Diseases, the Fifth Medical Center o f Chinese PL A General Hospital, Beijing 100039)
Correspondingauthor:WANGFusheng,Email:*****************;DAIXiaopeng,Email:***********************Supported by the Excellent Youth Science Foundation of Chinese PLA General Hospital (2019-YQPY-009); the Clinical Scientist Program of Peking University (BMU2019LCKXJ013)
Abstract: Objective This paper discusses the relationship between CD71 erythroid cells in peripheral blood and disease progression and the characteristics of these cells in people living with HIV-1. Methods The frequencies and characteristics of CD71* erythroid cells in peripheral blood of people living with HIV-1 were detected by flow cytometry, and the correlations with viral load, CD4 cell count and CD4/CD8 ratio were analyzed. Results 10 healthy controls (HCs) and 49 patients including 28 treatment naive patients (TNs) and 21 complete responders (CRs) who accepted successful antiretroviral therapy (ART) were enrolled in this study. Compared with HCs, TNs showed significantl
y increased frequencies of CD71 erythroid cells (mean 0.69% vs 2.79%), and CD71' erythroid cells significantly increased in TNs compared with CRs (mean 2.79% vs 1.18%). The frequencies of CD7T erythroid cells of TNs were positively correlated with viral load (r=0.5034, P=0.0063), and negatively correlated with that of CD4/CD8 ratio (r=-0.4640, P= 0.0129). The hemoglobin of TNs was lower than that of HCs (mean 148.9 g/L vs 157.8 g/L). The hemoglobin increased in CRs compared with that in TNs (mean 148.9 g/L vs 154.2 g/L), and the frequencies of CD71 erythroid cells were negatively correlated with hemoglobin in TNs (r=-0.4625, P=0.0132). The production of ROS of CD71 erythroid cells in TNs was significantly higher than that in HCs (mean 53.84% vs 66.64%). Compared with that in TNs, the production of
ROS of CD71 erythroid cells in CRs markedly decreased (mean 66.64% vs 43.82%). Conclusion
Expansion of CD7T erythroid cells in peripheral blood of people living with HIV-1 is associated with disease
progression and reduced hemoglobin.
Keywords: HIV-1; CD7T erythroid cells; disease
progression; hemoglobin; ROS
***********************
收稿日期：2020-09-23；修回日期：202卜02-24 基金项目：解放军总医院“优秀青年科学基金”培育专项（2019-
YQPY-009)；北京大学临床科学家计划（BMU2019IXKXJ013)
第一作者简介：吴逢英（1995—)，女，四川省自贡市人，硕士
在读，从事艾滋病临床免疫学研究。Email:*********************
通信作者：王福生，Email:*****************；代晓朋，Email:
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C L)71+红系细胞是一同时表达CD71(转铁蛋 白受体)和CD235a(红系标记物）的未成熟红系前体 细胞，具有免疫抑制活性12|。CD71+红系细胞通常 见于胎儿、新生儿脐带血、胎盘及肝睥中，在健康成 人的外周血中不存在或频率较低13。然而，贫血、怀孕和慢性感染等应激反应可引起外周血中出现 CD71+红系细胞…，通过受体-配体作用或分泌细胞 因子等机制，参与自身免疫性疾病7，肿瘤#和机体 免疫耐受」°：等发生发展，以及病原微生物的感染等 过程[2'n_12]。
AIDS是由HIV_1感染引起的以CD4细胞进行 性减少和慢性炎症为主要特征的慢性感染性疾病研究发现，CD71 +红系细胞通过细胞表面CD235a与HIV-I结合，将病毒转移给未感染CD4细 胞，促进HIV-1在体内持续感染；同时，CD71+红系细 胞通过依赖活性氧（reactive oxygen species,ROS)白勺机制上调CD4细胞N F-k B表达，促进HIV-1在靶细 胞内的转录与复制11]。目前CD71+红系细胞在HIV- I感染中的特点及临床意义尚不清楚，本研究分析了 HIV-1感染者外周血CD71+红系细胞的频率变化及 其与艾滋病疾病进展指标的相关性，并初步探究其 在HIV-1感染中发挥功能的潜在机制。
1对象与方法
1.1对象2019年7-12月期间在解放军总医院第 五医学中心爱心门诊就诊的HIV-1感染者，共计49 例，包括28例未接受过ART者（treatment na'i_v e parents，TNs)和 21 例免疫重建成功患者 (complete responder patients,CRs)，后者依据中国 艾滋病诊疗指 南(2018版），定义为患者经ART后，HIV所引起的免 疫异常改变能恢复至正常或接近正常水平，包括 CD4细胞数量和免疫功能的恢复。CRs组纳入标准 为：ART2年以上，CD4细胞计数>350个/|j l L，HIV- RNA<80copies/mL的HIV-1感染者。另收集10例 未感染HIV-1的健康人作为对照（healthy controls，HCs)。所有人组对象均排除HBV感染、HCV感染、结核杆菌感染及其他免疫系统疾病。本研究经解放 军总医院第五医学中心伦理委员会批准(R2016201DA020)，且人组对象均签署知情同意书。
1.2方法
1.2.1PBMC分离使用EDTA-K2真空采血管分 别抽取入组对象静脉血5 mL和2 mL，混匀后置于 4 1冰箱保存。5 mL管在4 h内使用离心机在室温 下以2 000 rpm/min的转速离心10 min，吸取上层血浆，检测HIV-1病毒载量，剩余下层细胞用人淋巴细 胞分离液(天津美德太平洋有限责任公司）采用密度 梯度离心法分离PBMC，最后使用磷酸盐缓冲液(phosphate buffered solution,PBS)洗漆 2 次，弃去上 清，用PBS将离心管底部细胞重悬至合适体积并进 行细胞计数。
丨.2.2全血CD4细胞、CD8细胞计数取入组对象
2 mL管内全血 50 txL至 Trucount管，加入 CD3/CD4/ CD8/CD45混合抗体(美国BD公司）20 (xL，涡旋仪震 荡混匀后于室温条件下避光孵育25 min，然后加人 溶血素(美国BD公司）450 pL并充分混匀，继续室温 避光孵育20 min，孵育完成后使用FACS Calibur型流 式细胞分析仪检测CD4细胞、CD8细胞，计算CD4/ CD8细胞比值。
1.2.3血浆HIV-1 RN A检测使用NPA-32P核酸 纯化仪（杭州博日公司）提取样本病毒核酸，采用 H1V-1套式反转录荧光定量聚合酶链反应检测试剂 盒（杭州博日公司），在 CFX96TM Real-Time system 型荧光定量聚合酶链反应分析仪(美国b io-r a d公 司）上检测HIV-1感染者血浆中HIV-1 KNA，核酸 检测范围为 80~ 1.8x1〇8copies/mL。
1.2.4 流式细胞仪检测外周血CD7；T红系细胞及其 R O S的表达将PBMC稀释到浓度为lxlO7个细胞/
mL，取细胞悬液100 |j l L，加人工作浓度为2.5 |xM的 MitoSox™ R ed线粒体超氧化物指币剂（美国invitro-gen公司），放人37丈水浴锅中避光孵育30 min，加人 提前预热至37 X：的2 mLPBS洗涤两次，弃去上清，加人100 |j l L PBS重悬细胞，加人表面染抗体CD235a-APC、CD7 卜APC-Cy7(美国 Biolegend公司）于4丈冰箱孵育30分钟染，孵育完成后，加入1 mLPBS洗涤，弃上清，加人300 |j l L含1%多聚甲醛溶 液固定，24 h内使用FACS Canto流式细胞分析仪检测。
1.3统计分析使用FbwjoVIO软件对流式数据进 行分析，米用GraphPad Prism 6.0对数据进行统计处 理并制图。组间比较采用Mann-Whitney U检验，相 关性分析米用Spearman相关检验。P<0.05表7K差异具有统计学意义。
2结果
2.1研究对象特征本研究共人组对象59例，分三 组。分别为TNs组、CRs组和HCs组，所有入组对象 均为男性，且人组对象各组别间年龄差异无统计学 意义。人组对象各组间样本量、CD4细胞计数、CD 8
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细胞计数、CD 4/CD 8细胞比值和HIV-l RNA 等基本 信息和临床资料详见表1。
表1研究对象基本信息与临床资料
特征
HCs 组(n=10)TNs 组（n=28)CRs 组(n=21)年龄/岁
29.8(23〜38)32.3(21-51)36.4(23-56)CD4细胞计数/(个/j j l L)681(461〜961)320(13-606)655(360〜1021)CD8细胞计数/(个/fxL)611(297〜1087)1100(425〜2541)829(341-1612)CD4/CD8细胞比值 1.19(0.63-1.55)
0.31(0.02 〜0.63)0.97(0.39〜2.24)
HIV-lRNA/(copies/mL)
-313 006( 1 351-4 160 632)
<80
注：数值为平均值,（）内为范围表示阴性。
2.2 不同组别CD 71+红系细胞的频率变化情况Cl )71+红系细胞流式分析典型图见图1-A ，通过分析 不同组别CD 71+红系细胞频率变化发现:TNs 组患者
CD 7丨+红系细胞频率明显高于HCs 组（平均值2.79%
仍.0.69%)，CRs 组患者经ART 后，CD 7 r 红系细胞频 率相比TNs 组降低(平均值丨.18% 2.79%)，但仍高于HCs 组(平均值 1.18%tw . 0.68%)(图 1-B )。
Gated on PBMC
SSC-A CD235a-
注：a：表示P<〇.〇5, b：表示P<0.000 1
图1不同组别CD7K 红系细胞频率变化情况
2.3 HIV -1感染者CD 71+红系细胞频率与血浆 HIV -1 RNA 、CD 4/CD 8细胞比值及CD 4细胞计数的相关性TNs 组患者外周血CD 71+红系细胞频率 与HIV -1 RNA 呈正相关（图2-A )，与CD 4/CD 8细胞 比值呈负相关（图2-B )，与CD 4细胞计数有负相关
趋势(图2-C )。
2.4不同组别血红蛋白含量差异及HIV -1感染者
CD 71+红系细胞频率与血红蛋白含量的相关性虽 然HIV -1感染者血红蛋白含量在正常值范围（131~ 172 g /L )内，但与HCs 组相比，TNs 组患者血红蛋白
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6.04.5 3.01.5
0.0
r =0.464 0
尸=0.012 9
••• ••*«
0.0 0.1 0.2 0.3 0.4 0.5 0.6 0.7 CD 4/CD 8细胞比值'•=-0.351 1
/?=0.067 0
0 100 200 300 400 500 600 700骨质瓷
CD 4细胞计数
图2 TNs 组患者CD71+红系细胞频率与血浆HIV-l RNA 、CD4/CD8细胞比值及CD4
细胞计数的相关性
含量降低（平均值158 g/Lw. 149 g/L)，CRs组患者经 ART后相比TNs组血红蛋白含量升高（平均值154 g/ Lw. 158g/L)，与健康人水平一致（图3-A)。TNs组 患者CD71+红系细胞频率与外周血血红蛋白含量呈 负相关(图3-B)。
2.5不同组别CD71+红系细胞ROS表达情况各组别流式分析比较典型图见图4-A，通过分析不同组别CD71+红系细胞产生ROS的能力，结果发现，与 HCs组相比，TNs组患者外周血CD71+红系细胞产生 ROS明显增多（平均值5
3.84%似.66_64%)，经ART 后CRs组患者相比TNs组ROS产生显著降低（平均 值43.82% 66.64%)，并且低于HCs组（平均值43.82% 队 53.84%)，见图4-B。
NS J165
£150 酬
.135
120
•I一♦參
•▲
1
••
1
直言命题
▲
HCs TNs
组别
CRs
TNs组
注：*：表示尸<0.05, b：表示/><0.01,NS (Not Significant)表示差异无统计学意义。
图3不同组别血红蛋白含量差异及TNs组患者CD71+红系细胞频率与血红蛋白含量的相关性
20
吕传赞H Cs
-1030 103I04105*1V jS TNs CRs Comp-PE-A:ROS 组别
注：a：表示PO.OS, b：表示P<0.01, e：表示PO.OOOhHCs («=10),TN s (”=14),C R s (n=15)。
图4不同组别CD71+红系细胞ROS表达情况
3讨论
本研究分析了 CD71+红系细胞在HIV-1感染者 外周血中的频率变化与特点及其在HIV-1感染中的 作用。CD71+红系细胞具有广泛的免疫调节作用。一方面，CD71+红系细胞分泌可溶性细胞因子，通过 精氨酸酶-2、程序性死亡配体1和R0S等途径，抑制 巨噬细胞、DC细胞、T细胞、B细胞、NK细胞等免疫 细胞功能；另一方面，CD71+红系细胞能够与免疫细 胞直接接触，通过PD-1:PDL-1/PDL-2通路抑制 CD4细胞和CD8细胞免疫反应m。
本研究发现，HIV-1感染者CD71+红系细胞频率 明显增加，且经ART后不能完全恢复，同时，TNs组 患者CD71+红系细胞频率与HIV-1 RNA呈显著正相关。CD71+红系细胞介导的病毒感染过程可能是导 致HIV-1不能被有效清除的重要原因。HIV-1感染 者CD4细胞计数以及CD4/CD8细胞比值是预测艾滋 病疾病进展的重要因素[14]，〇04/008细胞比值与 HIV-1感染者发生非艾滋病相关事件或死亡的风险 密切相关[15]。T N s组患者外周血C D71+红系细胞频 率与CD4细胞计数呈负相关趋势，与CD4/CD8细胞 比值呈显著负相关，提示TNs组患者外周血CD71+红 系细胞的频率变化与疾病进展密切相关。
血红蛋白降低可以诱导成人体内代偿性髓外造 血，外周血中出现CD71+红系细胞。贫血是HIV-1 感染者最常见的血液学异常之一，也是评价艾滋病 疾病进展的独立预后因素™。本研究中，TNs组患 者外周血血红蛋白含量低于HC组，经ART后恢复
，
并且TNS组患者血红蛋白含量与CD71+红系细胞频 率呈负相关。提示HIV-1感染者血红蛋白降低可导 致CD7 r红系细胞增多。此外，肝癌患者TGF_P分 泌能够刺激脾脏CD71+红系细胞生成'而H1V-1感 染者血浆TGF-p也明显升高[18，在HIV-丨感染中，TGF_p是否也可导致CD71+红系细胞水平升高需要 进一步研究。
骨髓来源的抑制性细胞通过产生ROS介导T细 胞免疫抑制19_2°]。研究发现，小鼠脾脏来源的CD7 r 红系细胞同样以依赖ROS的途径抑制CD8细胞增 殖8，而CD8细胞是HIV-1感染者发挥细胞免疫反 应的关键组成部分[21]。本研究发现，与HCs相比，HIV-1感染者外周血CD71+红系细胞高表达R0S，经
ART后显著降低，提示CD71+红系细胞可通过释放 R0S抑制T细胞功能，从而参与抑制机体的抗HIV-1感染免疫应答。由于此细胞含量较少，分选较为 困难，因此未在HIV-1感染者中进行体外实验进一 步验证CD7 r红系细胞对T细胞的明确作用。
综上所述，在HIV-1感染者中，血红蛋白降低促 进外周血CD71+红系细胞频率升高，并与疾病进展密 切相关;CD71'红系细胞通过分泌R0S发挥免疫抑制 功能。
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