陈贤燕;刘本;李英;陈智睿;梁盼盼;赖维;万苗坚
【摘 要】Objective:To examine the effect of different concentrations of androgen ( di-hydrotestosterone;DHT) on human follicle in vitro .Methods:Follicles were isolated and cultured with DHT of different concentrations from 10 -5 mol/L to 10 -9 mol/L.Then the growth rate of the follicles with or without DHT was observed , ki67 was used to assess the proliferation activity of hair matrix cells from each cultured hair follicle .Results:DHT at concentrations of 10 -5 mol/L and 10 -6 mol/L inhibited the growth of hair follicles compared with the control group ( P<0.05) , the hair matrix cell proliferation activity was weakened , and follicle entry into catagen phase was earlier than that of the control group .However, DHT at a concentration of 10 -7 mol/L promoted the growth of hair follicles compared to the control group ( P<0.05 ) ,the hair matrix cell prolifera-tion activity was strengthened , and follicle entry into catagen phase was later than that of the con-trol group.The effect of DHT on hair follicles at concentrations of 10 -8 mol/L and 10 -9 mol/L showed no significant differ约翰 格登
ence compared to the control group (P>0.05).Conclusion:Different concentrations of DHT had different effects on in vitro hair follicles .%目的：探讨不同浓度双氢睾酮（ DHT）对体外培养人毛囊生长的影响。方法：将分离的人毛囊培养于浓度为10－5 mol／L、10－6 mol／L、10－7 mol／L、10－8 mol／L、10－9 mol／L的DHT中，设置空白对照组，每日测量毛囊生长长度；运用免疫荧光技术评估各组毛囊毛母质细胞增殖程度。结果：不同浓度DHT对体外培养的毛囊生长产生不同影响：DHT培养浓度为10－5 mol／L、10－6 mol／L时抑制毛囊生长（正常对照组与DHT 10－5mol／L、10－6mol／L实验组毛囊每日平均生长长度相比，P值均＜0.05），毛母质细胞增殖活性减弱，毛囊较早进入退行期；DHT培养浓度为10－7 mol／L时促进毛囊生长（正常对照组与DHT 10－7mol／L实验组毛囊每日平均生长长度相比，P＜0.05），毛母质细胞增殖活性强，毛囊生长期（ana-gen）延长；DHT培养浓度为10－8 mol／L 、10－9 mol／L时对毛囊生长的作用与对照组相比无明显差异（正常对照组与DHT 10－8mol／L、10－9mol／L实验组毛囊每日平均生长长度相比，P值均＞0.05）。结论：不同浓度DHT对体外培养毛囊生长的影响不同。 【期刊名称】《皮肤性病诊疗学杂志》
【年(卷),期】2016(023)003
丹钦柯【总页数】5页(P156-160)
【作 者】陈贤燕;刘本;李英;陈智睿;梁盼盼;赖维;万苗坚
【作者单位】中山大学附属第三医院皮肤科，广东 广州 510630;中山大学附属第三医院皮肤科，广东 广州 510630;广州市第八人民医院，广东 广州 510060;中山大学附属第三医院皮肤科，广东 广州 510630;中山大学附属第三医院皮肤科，广东 广州 510630;中山大学附属第三医院皮肤科，广东 广州 510630;中山大学附属第三医院皮肤科，广东 广州 510630
【正文语种】中 文
【中图分类】R758.71
毛发的生长和更新受到多种激素调节，雄激素(androgen)便在其中扮演了一个重要角。睾酮(testosterone,T)是雄激素最主要的形式，毛囊主要通过5α还原酶将睾酮转化为双氢睾酮来参与毛发生长的调节[1]。雄激素对身体不同部位毛发的生长有着不同的作用，表现为
青春期后促进男性胡须的生长但抑制雄激素源性脱发(androgenetic alopecia，AGA)患者脱发区毛发的生长。在缺乏2型5α还原酶活性的男性假两性畸形患者，睾酮几乎无法形成有活性的双氢睾酮(dihydrotestosterone,DHT)，这些患者仅有极少量胡须生长，而没有AGA表现[2]。多囊卵巢综合症患者因体内雄激素增多而产生一系列临床症状，其中就包括上唇和腹部等部位毛发增粗增多。从这些疾病的临床表现我们可以注意到雄激素对于毛发生长的重要性，不同部位毛囊极有可能通过改变雄激素活性水平来调控毛发生长。现在虽然有学者发现AGA患者体内DHT水平升高，但目前尚没有直接证据表明AGA脱发区毛发生长的改变与高浓度DHT有关。因此，我们采用体外毛囊培养[3]探究了不同浓度DHT对人毛囊的作用，同时采用免疫荧光技术对培养毛囊的分期和增殖活性进行评估，旨在探讨DHT浓度变化对毛发生长的影响，为进一步阐明雄激素调控毛发生长的具体机制奠定基础。
鲎血
1.1 标本来源
紫花针茅头皮标本取自广州粤秀整形医院眉毛移植手术及中山大学附属第三医院脑外科手术中枕部和额顶部手术废弃头皮共7例，其中男3例，女4例，平均年龄(25.2±3.6)岁。供皮区局部无感染、脱发及其它毛发疾病。同一批次毛囊均按照同一条件进行培养。本研究经中山大学附属第三医院医学伦理委员会批准，志愿者均签署知情同意书。
1.2 主要仪器
解剖显微镜(Leica, German)、LAC倒置显微镜(NIKON, Japan)、脱水机(武汉俊杰JJ-12J)、包埋机(武汉俊杰JB-P5)、病理切片机(上海徕卡RM2016)、烤箱(上海福玛DGX-9003B)、倒置荧光显微镜(NIKON ECLIPSE TI-SR, Japan)、成像系统(NIKON DS-U3)。
1.3 主要试剂
双氢睾酮(Millipore，先用无水乙醇配制成10-2mol/L母液，再依实验需要用Williams E培养基稀释成对应浓度)、配制的Williams E无血清培养基(Gibco，各成分终浓度：谷氨酰胺2 mmol/L、Hepes 2 mmol/L、氢化可的松10 μg/L、牛胰岛素10 mg/L、转铁蛋白10 mg/L、亚硒酸钠10 μg/L、青霉素10×10 4u/L、链霉素100 mg/L)、ki67(兔抗人；1∶200；谷歌生物)、荧光二抗(山羊抗兔；1∶300；谷歌生物)、DAPI(谷歌生物)、BSA(solarbio)、抗荧光淬灭封片剂(谷歌生物)、4%多聚甲醛、二甲苯、梯度乙醇。
1.4 实验方法
1.4.1 毛囊分离
头皮标本浸没在生理盐水中放冰上取回，离体4 h内进行毛囊分离。用生理盐水清洗头皮，去除残留血液。在含2%双抗(青、链霉素)D-Hanks缓冲液中漂洗2 min后，用含1%双抗D-Hanks缓冲液漂洗2次，每次2 min。利用压舌板及10号刀片顺毛囊纵轴方向将大小约10 mm×3 mm的皮条依次分成粗胚、细胚及单株毛囊，全程冰上操作。在解剖显微镜下，用显微镊及10号刀片小心去除毛囊根部周围脂肪组织，在毛囊真、表皮与皮下组织结合处切断毛囊，弃去毛囊真、表皮部分。挑选结构完整的生长期Ⅵ期毛囊进行毛囊培养[4]。
寄语市长
1.4.2 毛囊培养
在24孔培养板中加入配制的WilliamsE无血清培养基，将分离好的毛囊用显微镊逐一转移到培养板中，每孔1根，在倒置显微镜下观察毛囊形态，并用LAC成像系统测量毛囊的初始长度(毛乳头根部至毛根中点)。将毛囊置于37 ℃、5%CO2培养箱中悬浮培养。培养24 h后对生长明显的毛囊(生长长度在0.3～0.4 mm之间)进行分组培养[4]，每组16～18根。各组中依次加入双氢睾酮终浓度为10-5mol/L、10-6mol/L、10-7mol/L、10-8mol/L、10-9mol/L的WilliamsE无血清培养基，并设置相同浓度无水乙醇培养组为对照组。每日于倒置显微镜下观察毛囊形态变化，测量毛囊生长长度并记录。
1.4.3 免疫荧光评估毛囊毛母质细胞增殖程度
将培养10天的毛囊固定于4%多聚甲醛6 h后，顺毛囊纵轴方向进行脱水包埋。切3 μm石蜡切片，梯度二甲苯脱蜡，置于EDTA抗原修复液(PH8.0)中微波修复，冷却后PBS洗涤3次，每次5 min。BSA室温封闭30 min后在组织上滴加50 μL按比例稀释好的一抗，4 ℃孵育过夜。PBS洗涤3次后在组织上滴加50 μL与一抗对应种属的二抗，避光孵育50 min。PBS洗涤3次后在组织上滴加DAPI染液，避光室温孵育10 min。抗荧光猝灭剂封片。切片置于倒置荧光显微镜下观察并采集图像，每组观察10个毛囊。
1.4.4 统计学分析
采用SPSS16.0软件，各组数据均以±s表示，组间比较采用单因素方差分析，结果有统计学意义则进一步采用LSD法对正常对照组和DHT各浓度组进行两两比较。
2.1 毛囊生长速度
将生长期Ⅵ期的健康人毛囊分组培养于William’ s E无血清培养基或分别添加有10-5～10-9mol/L DHT的培养基中。每日检测培养毛囊的毛干延伸长度。正常对照组毛囊生长良好，
表现为毛干明显伸出毛囊顶端；DHT 10-8mol/L、10-9mol/L实验组毛囊生长长度与对照组基本一致；DHT 10-7mol/L实验组毛囊毛干延长长度较对照组明显增加；而DHT 10-5mol/L、10-6mol/L实验组毛干延伸长度较对照组相比明显缩短。通过测量计算，各组毛囊的每日平均生长长度、方差分析及LSD检验结果如表1所示：DHT 10-5mol/L、10-6mol/L、10-7mol/L实验组与对照组相比均有明显差异(t值分别为2.54、2.08、-2.10；P值分别为0.014、0.042、0.041)。
2.2 毛囊形态改变
毛囊退行期的典型改变就是毛乳头与毛囊基底的距离拉长，杵状发形成，毛囊弯曲扭折。正常对照组在培养第6天开始进入退行期早期(即毛乳头上移、毛囊出现弯曲扭折[5] )，而抑制毛囊生长的DHT 10-5mol/L、10-6mol/L实验组在培养第4天已出现类似改变；相比之下，促进毛囊生长的DHT 10-7mol/L实验组毛囊培养至第10天仍未出现退行期改变(图1)。
2.3 毛囊毛母质细胞增殖评估
毛囊依靠毛母质细胞增殖分化形成多种毛囊细胞，实现毛干的延伸，而毛母质细胞的细胞
核增殖抗原ki67表达量是判断毛囊增殖活性的重要指标，生长期毛囊毛母质细胞ki67表达量高，而毛囊进入退行期后ki67表达明显减少。各组毛囊Ki67表达结果判读：细胞核出现红荧光；各组毛囊可见不等量的ki67阳性细胞(图2A～2D，白箭头所示)。DHT浓度为10-5mol/L、10-6mol/L的培养毛囊仅见少量毛母质细胞有ki67表达，表明毛母质细胞增殖活性减弱；而DHT培养浓度为10-7 mol/L的毛囊毛母质细胞ki67表达明显强于对照组，表明毛母质细胞增殖活性增强。
毛囊自发育成熟开始即处于生长期—退行期—休止期的周期循环之中，从而维持着毛发的更新。毛囊的发生和周期循环过程受许多激素调控，雄激素便在其中扮演了一个重要角。
雄激素主要包括睾酮、雄烯二酮和脱氢表雄酮，睾酮(Testosterone, T)是其最主要的形式。雄激素功能的行使需依靠5α还原酶的作用，1型和2型 5α还原酶均能将睾酮转化成有活性的双氢睾酮[6]。研究发现，在AGA患者中，全身或局部雄激素水平的升高可引起脱发区毛囊产生微型化改变[7-8]，而临床上可以注意到高雄激素水平的AGA患者脱发区毛发生长受抑制但胡须生长却不受抑制。Wilson[9]、Andersson等[10]发现AGA患者脱发区与非脱发
区、胡须部的1型5α还原酶表达无差异而2型5α还原酶表达有异，且阻止雄激素向其活性形式DHT转化的2型5α还原酶抑制剂能有效阻碍AGA的发展进程，这说明不同部位毛发生长情况的差异与2型5α还原酶的表达水平差异有密切关系。Farthing等[11]还发现面部毛发生长速度和血浆DHT水平明显相关。我们以此推测人体不同部位毛囊可能通过调控2型5α还原酶来改变毛囊DHT水平，从而调控毛发生长。
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