PC12细胞氧糖剥夺模型细胞自噬与损伤的关系及黄芪甲苷的保护作用研究公案小说
黄小平;李静娴;杨筱倩;丁煌;唐标;刘晓丹;邓常清
【摘 要】目的:研究PC12细胞OGD/R后自噬与损伤的经时性变化以及黄芪甲苷的干预效应.方法:探讨PC12细胞OGD/R后不同时间自噬的变化及与细胞损伤的关系,初步确定细胞发生自噬性损伤的时间点,再制作PC12细胞OGD/R自噬性损伤模型,研究黄芪甲苷抗自噬性损伤的作用.结果:复糖复氧6～36 h后,细胞存活率降低、LDH漏出率增加;用3-MA预处理后,可使复糖复氧6～12 h细胞存活率降低、LDH漏出率增加,复糖复氧后24～36 h相反.激光共聚焦和west-ern-blot检测显示,复糖复氧后6 hLC3、LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ比值增加,至24h达高峰;p62蛋白表达随再复糖复氧时间的延长逐渐降低.黄芪甲苷对OGD 2 h复糖复氧24 h的PC12细胞自噬具有显著抑制作用,且呈剂量依赖性.结论:PC12在在OGD复糖复氧6～12 h,自噬减轻神经细胞的损伤,而在24～36 h后加重细胞损伤;黄芪甲苷可通过抑制细胞过度自噬诱导的细胞损伤,从而发挥对受损细胞的神经保护作用. 【期刊名称】《世界中医药》
【年(卷),期】2016(011)004
利用三角形全等测距离【总页数】宝石岛7页(P597-603)
【关键词】PC12细胞;氧糖剥夺再复糖复氧;细胞自噬;细胞损伤;黄芪甲苷;保护作用
【作 者】黄小平;李静娴;杨筱倩;丁煌;唐标;刘晓丹;邓常清
【作者单位】湖南中医药大学分子病理实验室,中西医结合心脑疾病防治湖南省重点实验室,细胞生物学与分子技术湖南省高校重点实验室,长沙,410208;湖南中医药大学分子病理实验室,中西医结合心脑疾病防治湖南省重点实验室,细胞生物学与分子技术湖南省高校重点实验室,长沙,410208;湖南中医药大学分子病理实验室,中西医结合心脑疾病防治湖南省重点实验室,细胞生物学与分子技术湖南省高校重点实验室,长沙,410208;湖南中医药大学分子病理实验室,中西医结合心脑疾病防治湖南省重点实验室,细胞生物学与分子技术湖南省高校重点实验室,长沙,410208;湖南中医药大学分子病理实验室,中西医结合心脑疾病防治湖南省重点实验室,细胞生物学与分子技术湖南省高校重点实验室,长沙,410208;湖南中医药大学分子病理实验室,中西医结合心脑疾病防治湖南省重点实验室,细胞生物学与分子技术湖南省高校重点实验室,长沙,410208;湖南中医药大学分子病理实验室,中西医结合心脑疾病防治湖南省重点实验室,细胞生物学与分子技术湖南省高校重点实验室,长沙,410208
【正文语种】中 文
【中图分类】R965
自噬(Autophagy),即自体吞噬,是近年来逐渐被认识的细胞除坏死和凋亡外的第3种死亡方式[1],是细胞受到刺激后,通过溶酶体途径降解细胞内物质的统称。正常自噬能清除体内异常蛋白质及受损或过多的细胞器,从而维持着细胞的存活、分化、发育和稳态;而自噬过度,可诱发自噬性细胞死亡,并和凋亡、坏死交互作用,使细胞损伤加重[2-4]。缺血缺氧是自噬激活的重要诱因,有研究表明,脑缺血后自噬发挥了双刃剑的作用。在轻度缺氧等情况下,自噬能够通过降解损伤的蛋白和细胞器为合成新的蛋白提供原料和能量,从而对组织细胞发挥修复作用;若损伤过重,如重度缺氧,或组织细胞损伤时间长,自噬过度激活,则促进对组织细胞的损伤[5-7]。目前通过采用PC12细胞建立氧糖剥夺(或复糖复氧)模型,模拟脑缺血(或再灌注)后研究神经细胞自噬的变化已有一些报道[8-13]。但氧糖剥夺/复糖复氧后不同时间,PC12细胞自噬发挥了怎样的动态变化?这种改变与氧糖剥夺/复糖复氧导致的神经细胞损伤具有何种关系?对这些问题都不清楚。黄芪是心脑血管疾病的常用中药,黄芪总苷(Astragalosides,AST)是黄芪中具有心脑血管药理作用的药效物质,主要含黄芪甲苷(Astraga
loside IV)。已有研究表明AST及其有效成分AstragalosideⅣ具有抗脑缺血后氧化损伤[14-16]。我们前期研究也表明,AST抗缺血再灌注后神经细胞损伤的作用可能与其改善脑组织能量代谢、通过抑制JNK信号转导通路活化从而抑制线粒体凋亡途径有关[17]。但其对脑缺血再灌注后神经细胞自噬性损伤有何影响,应当以什么样的剂量可以更好地达到抗缺血性脑损伤的效果,都还不清楚。因此,本研究首先探讨了PC12细胞氧糖剥夺再复糖复氧不同时间点细胞自噬与损伤的关系,确定自噬引起细胞产生损伤的氧糖剥夺复糖复氧的可能时间点,并制作PC12细胞氧糖剥夺再复糖复氧产生自噬性损伤的细胞模型;然后再在此基础上进行黄芪甲苷抗自噬性损伤的作用研究,为其进一步地研究和临床的合理应用提供科学依据。
周孝德
1.1 试剂 神经生长因子(Nerve Growth Factor, NGF)(美国sigma,批号N2513);蛋白裂解液(中国CW Biotech,批号0414K);蛋白酶抑制剂(中国CW Biotech,批号0815A);二甲基亚砜(Dimethyl Sulphoxide,DMSO)(美国MP Biomedicals,批号196055);噻唑蓝(3-(4,5-dimethyl-2-thiazolyl)-2,5-diphenyl-2-H-tetrazolium bromide,MTT)(中国Solarbio公司,批号M8181);乳酸脱氢酶(LDH)试剂盒(中国南京建成生物有限公司,批号20140327);兔抗大鼠微管相关蛋白3(microtubule-associated protein 1 light chain 3,LC3)一抗(日本MBL,批号PM036);兔抗大鼠sequesto-some-1(SQSTM1/P62)一抗(美国Proteintech,批号18420-1-AP);小鼠抗大鼠β-
actin一抗(美国Proteintech,批号60008-1-lg);荧光素四甲基异硫氰酸罗丹明(tetraethylrhodamineisothiocyanate, TRITC)标记羊抗兔二抗(中国Boster,批号: BA1090);Hochest 33258(中国Solarbio,批号COO20 10);辣根过氧化物酶(Horseradish Peroxidase,HRP)标记的羊抗兔、羊抗小鼠二抗(美国proteintech,批号SA00001-1、SA00001-2);3-Methyladenine(3-MA)(美国selleck,批号S2767)。
1.2 受试药物 黄芪甲苷(批号:A0070),购自中国成都曼思特生物科技有限公司,纯度≥98%。黄芪甲苷以含0.1%DMSO-PBS溶解。
1.3 细胞 PC12细胞,来源于大鼠的肾上腺嗜铬细胞瘤细胞,高分化,永生性,在美国模式菌种收集中心(American Type Culture Collection,ATCC)中的编号为CRL-1721,购自武汉大学中国典型培养物保存中心。-
2.1 PC12细胞的培养与NGF诱导 PC12细胞以含10%胎牛血清的DMEM高糖培养基于37℃、20%O2、75%N2、5%CO2及饱和湿度的培养箱中培养,2d换液1次,待细胞生长融合后传代培养。细胞以1×104/mL接种于96孔培养板,每孔0.18 mL,培养24h待细胞贴壁后再加终浓度50 μg/L的NGF诱导分化48h后[18],弃原培养液,加入无血清培养基培养24h,使细胞同
步化到G0期后备用。
2.2 PC12细胞氧糖剥夺复糖复氧后自噬的经时性变化及与损伤的关系
2.2.1 实验分组及氧糖剥夺后复糖复氧 实验分为正常对照组、氧糖剥夺后复糖复氧模型组(缺糖缺氧2h后复糖复氧6h、12h、24h、36h)和自噬抑制剂组。细胞以DMEM高糖培养液(含10%胎牛血清和1%青链霉素)接种于96孔培养板,每孔200 μL, 置37℃、20%O2、75%N2、5%CO2及饱和湿度的培养箱中常规培养2h后进行如下处理:正常对照组换DMEM高糖培养液同上常规培养。模型组加200L的无糖Earle’s培养液,置于三气培养箱中(5% CO2,1%O2,94%N2)模拟缺糖缺氧培养2h后[19],换成DMEM高糖培养液常规培养进行复糖复氧,分别于复糖复氧后6h、12h、24h、36h终止培养进行检测。自噬抑制剂组于缺糖缺氧前30min加入终浓度25 mmol/L[20-21]的3-MA,再进行缺糖缺氧和复糖复氧培养。
2.2.2 细胞生存测定和LDH漏出率测定 采用MTT法。细胞上述处理完成后,加入20 μL 5 mg/ mL的MTT继续培养4h,弃上清后加200 μL的DMSO,震荡10min后于490 nm处检测光密度值(OD)。OD值越大,则细胞存活越多,细胞损伤越少。细胞上述处理完成后,分别吸取培养液,1 000 r/min离心10min,取上清检测培养液中的LDH活性。然后将细胞用PBS洗涤3次后
再用等量培养液悬浮,置-20℃、37℃反复冻融3次,再将冻融液1 000 r/min离心10min,取上清检测作为细胞冻融液的LDH活性。按LDH试剂盒说明方法测定LDH活性,并计算出细胞LDH漏出率[21]:LDH漏出率(%)=培养液LDH活性/(培养液LDH活性+细胞冻融液LDH活性)×100%。
网上冲印系统2.2.3 自噬体形态和数量测定:PC12细胞以1× 104/mL接种于6孔板中,细胞培养及处理同前,吸去上清,PBS洗1次后加入2.5%戊二醛固定液固定过夜,1%锇酸后固定2h,依次以50%、70%、90%、100%的丙酮脱水,包埋、染后以透射电子显微镜(美国FEI,型号Tecnai G2 spirit)观察单位面积细胞内自噬体数目和形态。
2.2.4 细胞LC3Ⅱ定位及相对定量检测:正常情况下LC3蛋白主要以LC3-Ⅰ形式散在分布于胞浆中,激光共聚焦显微镜检测LC3蛋白可见胞质中出现弥散状荧光;若细胞出现自噬则表现为LC3-Ⅱ的形成和在胞浆的聚集,激光共聚焦显微镜检测LC3-Ⅱ蛋白可见胞质中出现斑片状荧光体。PC12细胞以1× 104/mL接种于24孔板中,制作细胞爬片,细胞培养及处理同前,吸去上清,PBS洗一次后加4%多聚甲醛固定15min,PBS洗3次,加0.5%曲拉通10min 后,PBS洗3次,再加1%牛血清白蛋白封闭液封闭1h后,加兔抗大鼠微管相关蛋白LC3一抗(1∶500) 4℃孵育
过夜,PBS洗3次,加TRITC标记的羊抗兔荧光二抗(1∶100)室温孵育30min,PBS洗3次,加Hochest33258(1∶200)10min,PBS洗3次,甘油封片后于激光共聚焦显微镜下(日本NiKon,型号A1130309)观察斑片状荧光体。Image Pro-Plug6.0图像分析软件测定细胞面积及斑片状荧光体个数,计算单位面积的斑片状荧光体个数。
2.2.5 细胞LC3、p62蛋白定量检测 以western blot法测定。PC12细胞以1×104/mL接种于6孔板中,细胞培养及处理同前,吸去上清,PBS洗一次后加500 μL的PBS,用细胞刮刮下细胞,1 000 r/min离心5min,弃去上清,加入100 μL的蛋白裂解液和1 μL的蛋白酶抑制剂,冰上充分混匀后静置20min 后12 000 r/min离心10min,取上清,BCA试剂盒测定总蛋白含量。取30 μg蛋白100℃水浴10min变性后,120 v恒压电泳70min后,200 mA转膜2h, 5%脱脂牛奶封闭1h,再分别与兔抗大鼠LC3一抗(1∶500)、兔抗大鼠p62一抗(1∶500)和小鼠抗大鼠β-actin一抗(1∶1 000)溶液混合,4℃静置过夜,TBS 洗3次后TBST洗1次;然后分别加羊抗兔二抗(1∶2 000)或羊抗小鼠二抗(1∶2 000),37℃孵育1h, TBS洗3次后TBST洗1次,暗室中加ECL化学发光剂显影。Image Pro-Plug6.0图像分析软件测定目的条带的累积光密度值(IOD),以目的条带的IOD与β-actin条带的IOD的比值作为该目的蛋白的相对表达量。自噬发生后,胞浆型LC3(即LC3-I,分子量为18kD)会酶解切掉一小段多肽,转变为(自噬体)膜型LC3(即LC3-II,分
子量为16 kD),通过Western-blot可以检测到两个条带的蛋白质,用LC3-II相对表达量与LC3-I相对表达量的比值代表自噬水平的高低。
赤杨
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