杨婵;王瑞嘉;何婧琳;肖慧;邓伟;向建南;曹忠
【摘 要】杂交链式反应(Hybridization chain reaction,HCR)是一种新型的信号扩增技术,它利用分子识别和杂交反应依次打开多个发卡探针,得到累计信号,实现选择性检测靶分子的目的.其特点是整个反应过程无酶参与,避免了非特异性扩增对分析结果的影响,且反应条件温和,易控制.基于这些特点,HCR受到了研究人员广泛的关注,并结合各种DNA探针用于检测各种目标物,如:DNA、蛋白质、生物小分子、金属离子等等.该文总结了近些年来HCR反应在生物传感探针设计方面的应用.买淫
【期刊名称】《化学传感器》
【年(卷),期】2017(037)003
【总页数】9页(P8-16)
【关键词】杂交链式反应;生物传感器;DNA探针;应用
【作 者】杨婵;王瑞嘉;何婧琳;肖慧;邓伟;向建南;曹忠
【作者单位】长沙理工大学化学与生物工程学院,电力与交通材料保护湖南省重点实验室,微纳生物传感与食品安全检测协同创新中心,湖南长沙410114;湖南大学化学化工学院,化学生物传感与计量学国家重点实验室,湖南长沙410082;长沙理工大学化学与生物工程学院,电力与交通材料保护湖南省重点实验室,微纳生物传感与食品安全检测协同创新中心,湖南长沙410114;长沙理工大学化学与生物工程学院,电力与交通材料保护湖南省重点实验室,微纳生物传感与食品安全检测协同创新中心,湖南长沙410114;湖南大学化学化工学院,化学生物传感与计量学国家重点实验室,湖南长沙410082;湖南大学化学化工学院,化学生物传感与计量学国家重点实验室,湖南长沙410082;长沙理工大学化学与生物工程学院,电力与交通材料保护湖南省重点实验室,微纳生物传感与食品安全检测协同创新中心,湖南长沙410114
【正文语种】中 文
0 引言
生物传感器是一种结合了生物敏感元件、物理化学信号转换器和电子信号处理器的新兴仪
器，其工作原理是将生物敏感元件在发生特异性反应时所产生的信号经由物理化学信号转化器，转化为光、电、声等易被检测到的信号，最终通过换算等手段获知待测物的有关信息[1]。近年来，生物传感技术由于具有灵敏度高、选择性好、成本低以及能够进行连续监测等优点，成为了一类新型的传感技术。它在基因分析、遗传疾病诊断、法医鉴定和环境监测等领域具有极大的应用潜力和广阔的发展空间，因此成为科学研究者研究的重点。
提高生物传感技术的灵敏度，关键依赖于信号的放大，而信号放大的方法普遍使用的是核酸扩增技术，它是一种对特定序列DNA进行体外扩增的技术[2-3]。核酸扩增技术根据扩增是否经过温度变化主要分为两类：一类是核酸变温扩增反应，主要有聚合酶链式反应（Polymerase chain reaction,PCR）、连接酶链式反应 （Ligase chain reaction,LCR）。杂交链式反应技术（Hybridization chain reaction,HCR）、滚环等温扩增技术（Rolling circle amplification,RCA）、链替代等温扩增技术（Strand displacement amplification,SDA）等。但是，在恒温条件下，不需要酶参与的扩增技术只有HCR反应。
PCR技术是一种在DNA聚合酶的辅助下，以母链DNA作为模板，将特定引物作为延伸起点，经过高温变性、低温退火和恒温延伸三个步骤的多次循环，复制出与母链DNA互补的
子链DNA[4-8]的一种核酸扩增手段。PCR技术拥有着高灵敏度、高特异性、对模板纯度要求低以及重现性好等多方面的优点，已被广泛应用于转基因、病原体定量检测、疾病分类以及药物疗效考核等领域的研究。但是该扩增技术也存在以下缺点，如：需要精密的仪器设备、易产生假阳性反应[9]、不适用于基层及现场的快速检测等。
LCR是Barany[10]在1991年从水生栖热菌中提取耐高温的DNA连接酶，并利用该连接酶成功的扩增了DNA时所发现的一种新型的核酸扩增反应方式，Barany也正式将这种方法命名为连接酶链式反应。该方法的关键点是耐高温的DNA连接酶对连接缺口具有高保真的要求，且连接酶在多次循环中始终能保持活性，提高了LCR的特异性。
相对于 PCR和 LCR反应，RCA、SDA与HCR反应在恒温条件下就可以进行核酸扩增。RCA是Landegren[11]发明的一种基于模拟自然界微生物环状DNA的滚环式扩增机制而构建的体外核酸等温扩增技术。它以环状DNA做模板，在dNTPs存在的条件下，引物与模板杂交后通过DNA聚合酶使引物沿着环状DNA模板进行复制。因为DNA聚合酶具有链置换效应，因此新合成的链可以不断延长，最终得到一段具有重复序列单元的DNA长链，实现检测信号放大的目标。RCA包括线性RCA和指数RCA两种形式，线性RCA是引物结合到环状
DNA上后，在具有链置换效应的DNA聚合酶作用下被延伸，最终扩增成为具有大量重复序列的线状单链。而指数RCA相比较线性RCA而言，仅多采用了一条与环状DNA序列完全一致的第二条引物，第二条引物可与第一次线性RCA的产物结合并酶促延伸，可在很短的时间内实现指数扩增。
RCA技术具有高灵敏度、强特异性、设备要求简单、高通量等一些列优点，因而得到广泛的应用。目前主要用于痕量的分子检测领域，主要有全基因组扩增[12]、蛋白质芯片分析[13]、单核苷酸多态性[14]、细胞原位检测[15]等领域。但RCA也存在着琐式探针长度较长（一般100 nt左右）、合成费用高等缺点。
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SDA技术最早由Walker等[16]提出。它是一种基于酶促反应的体外核酸等温扩增技术，其原理在于限制性内切酶剪切DNA识别位点的能力及DNA聚合酶在切口处向3'端延伸并置换出下游序列，于恒温条件谢爱实现扩增。被置换的DNA单链与引物结合，在DNA聚合酶的作用下延伸成双链。该延伸过程不断的重复，最终使得目标DNA序列呈指数增长。因SDA技术具有快速、高效、特异等优点，因而受到广泛关注并被不断改良。
HCR反应是由Pierce和Dirks在2004年提出的一种体外核酸等温信号放大技术[17]，是一个
没有酶参与的过程。它的原理如图1所示，HCR元件包括两个部分：引发探针、两条可杂交互补并带有粘性末端的发夹型DNA（H1和H2）。当不存在引发探针时，两条发夹探针稳定存在于溶液中。若存在引发探针时，引发探针触发HCR反应开始，发夹探针H1与H2相继打开，形成具有多个重复单元的共聚物[18-19]，直到发夹探针H1与H2消耗完为止，以此来实现信号扩增的目的。HCR的优点在于不需要酶的辅助，避免了非特异性扩增对分析结果的影响，反应条件温和、易控制，等温条件下经一步反应就可以实现短链DNA的扩增，并不需要复杂的仪器设备。HCR这一信号扩增技术与各类检测技术(如：荧光法、比法、电化学法等)都具有较高的兼容性，基于以上优点，研究人员利用HCR反应提高核酸、蛋白、小分子及重金属等生物分子检测的灵敏度。与其他核酸扩增方法相比，HCR最大的优势是无酶参与，为研究者们的研究提供了很大的便利。
图1 杂交链式反应的原理图[17]Fig.1 Schematic illustration based on hybridization chain reaction[17]
1 HCR在分子信标探针设计方面的应用
超固态分子信标(Molecularbeacon，MB)是一种根据核酸碱基配对原则和荧光共振能量转移(Fluor
escence resonance energy transfer,FRET)现象来设计的发卡型寡核苷酸探针[20]。MB由茎区部分、环区部分、荧光供体基团和猝灭受体基团四部分构成，环区部分一般有15-30个核苷酸长，并与目标序列互补;茎区部分一般有5-7个核苷酸长，并相互配对形成茎的结构。荧光供体基团和猝灭受体基团分别被标记在探针的两端。分子信标的作用原理如图2所示，MB的环状部分由和目标序列互补的核苷酸序列组成，当MB体系中未加入待检测目标序列时，MB的荧光供体基团和猝灭受体基团之间的距离很小，发生荧光共振能量转移现象，供体分子荧光被受体基团猝灭。当MB体系中加入待检测的目标序列时，由于碱基间的互补配对，使MB发夹结构发生变化，导致供体基团和受体基团之间的距离变大，FRET被破坏，荧光显现。MB法不仅操作简单、灵敏度高、特异性强，而且还可以避免核酸交叉污染，同时实现实时检测。
图2 分子信标原理Fig.2 The principle of molecular beacon
2012年，谭蔚泓等[21]利用HCR放大技术与芘MB的核酸发夹探针结合，构建一种灵敏检测目标DNA的荧光传感器。原理如图3所示，两个发夹探针H1*与H2*用芘分子进行标记。当目标DNA不存在的时候，H1*与H2*呈发夹结构，稳定存在于体系中，而芘分子以单体形式
川子和嘟嘟存在，荧光较低。当目标DNA存在的时候，目标DNA作为引发链，引发H1*、H2*与之杂交，发生HCR反应，而芘分子以二聚体形式存在，致使荧光强度增加，根据前后荧光强度的变化来检测目标DNA。该实验可用于复杂生物中DNA的检测。
图3 基于HCR放大技术检测DNA[21]Fig.3 Working principle behind the detection of DNA on the basis of HCR amplification[21]
2 HCR在G-quadrup lex探针设计方面的应用
Gellert小组[22]在1962年首次报道了基于碱基G的G-四分体结构（G-quartet）。富含碱基G的G-DNA序列通过对应G碱基之间形成Hoogsteen氢键，使得4条或4段富含G碱基的DNA片段肩并肩的形成G-四分体，再通过纵向鸟嘌呤杂环之间的π-π作用形成G-四链体结构（G-quadruplex），这种结构如图4所示。在G-quadruplex的中轴方向有易极性中央孔道，可以螯合适当体积的阳离子[23]（如：K+、Li+、Na+），增强G-quadruplex的结构稳定性。
划线更正法图4 G-四分体的多种结构[22]Fig.4 Conformations of several G-quartets[22]
2012年，Dong J等[24]利用结合 HCR与G-quadruplex构建了一种免标记检测目标DNA的荧光传感器。实验原理如图5A所示，目标DNA不存在时，没有引发链引发杂交链式反应，荧光强度较低。目标DNA存在时，目标DNA作为引发链打开两个发夹探针与其杂交，进行杂交链式反应形成长双链，释放出G-quadruplex结构，加入锌卟啉（ZnPPIX）后，荧光强度增强。体系前后荧光强度的变化可以检测目标DNA。2015年，Alexander Trifonov等[25]利用 HCR反应与 G-quadruplex结合，电化学检测目标DNA。实验原理如图5B，该传感系统把目标DNA被固定在金电极上，作为引发剂与两个发夹探针发生杂交反应形成长双链，完成杂交链式反应，释放出更多的 G-quadruplex。 加入血红素（hemin）后，导致hemin/G-quadruplex电催化H2O2还原成H2O，使电化学信号扩增,达到检测目标DNA的目的。
图5 HCR扩增（A）荧光（B）电化学检测DNA序列的原理图[24-25]Fig.5 Schematic illustration of the HCR based fluorometric(A)or electrochemical(B)sensors for DNA sequences detection[24-25]
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