陈庆山
* 刘春燕 刘迎雪 刘海燕 陈立君 付 尧 单继勋 郭 强 张丽娜
(东北农业大学大豆研究所 哈尔滨 150030)
摘要 核酸体外扩增是分子生物学研究的基础。随着生物技术的发展，出现了越来越多的核酸体外扩增技术。根据其特点可分为两类：一类是靶核酸的直接扩增，如聚合酶链式反应、链替代扩增、连接酶链式反应、核酸依赖的扩增、Q 复制、转录介导的扩增和滚环扩增等；另一类是信号放大扩增，如支链DNA、侵染探针等。就现有的核酸扩增技术的原理、特点及应用进行介绍。
关键词 核酸体外扩增 靶核酸直接扩增 信号放大扩增
核酸分子体外扩增技术是开展分子生物学研究的基础。随着生物技术的发展，建立一套灵敏、快速的核酸扩增技术一直是研究工作者探讨的问题。在聚合酶链式反应(PCR)以其灵敏性、特异性和快速性而广泛应用的基础上，新的核酸扩增模式也不断涌现。现有核酸扩增技术根据其特点可分为两类：第一类是靶核酸的直接扩增；包括聚合酶链式反应(PCR)、链替代扩增(SDA)、连接酶链式反应(LCR)和核酸依赖的扩增(NASB A)、Q 复制、转录介导的扩增(TMA)和滚环扩增(RC A)。另一类是信号放大扩增；包括支
链DNA(bDNA)、侵染探针(Invader)和滚环扩增(RCA)等[1]。其中滚环扩增是一种既能直接扩增靶核酸，又能实现信号放大扩增的方法。根据是否需要温度循环也可分为两类：一类是非等温扩增体系，如聚合酶链式反应(PCR)、连接酶链式反应(LCR)等。另一类是等温扩增体系，如链替代扩增(SDA)、核酸依赖的扩增(NASBA)、支链DNA(bDNA)、滚环扩增(RCA)、Q 复制酶系统。本文根据扩增特点将各种核酸扩增技术进行总结，见表1。
收稿日期:2004 01 12 修回日期:2004 03 01 *:qs hchen@ 表1 核酸扩增技术的特点
核酸扩增分类
特点
DNA扩增RNA扩增D NA信号放大R NA信号放大蛋白质信号放大体内扩增微阵列上扩增非等温PCR++---+-
扩增LCR+------
靶核酸SD A++----+
直接NASBA++-----
扩增
等温扩增
TMA++-----
Q 复制-+-----
R CA+++++++
信号放大扩增
bDNA--++---等温扩增Invader--++---R CA+++++++
1 靶核酸直接扩增
1 1 聚合酶链式反应(PC R)
自1985年Mullis等发明了具有划时代意义的聚合酶链反应，使体外无限扩增核酸片段得以实现[2]。PCR现已广泛用于DNA的扩增。随着技术手段的进步,PC R技术家族也不断涌现出新成员，其中有简并PCR、复合PC R、反向PCR、锚定PCR等百余种。
聚合酶链式反应是应用一对寡核苷酸引物结合到正负链上的靶序列两侧，从而酶促合成多个拷 第24卷第5期中 国 生 物 工 程 杂 志
CHINA BIOTEC HNOLOGY2004年5月
中国威胁论
贝的靶序列DNA片段。PC R的每一循环都包括DNA变性，引物复性和由DNA聚合酶催化的延伸反应。每次循环新合成的DNA片段又可成为下次循环的模板，这就导致靶序列DNA的指数扩增。经20~30次循环可使靶序列放大百万倍左右。
随着PCR种类的增加,PCR技术也被应用到生物技术的各个方面。例如利用PCR技术在靶序列中引起突变，这是由于PCR反应可以耐受引物和靶序列间某种程度的错配。现已用PC R产生替代、缺失或插入突变，也可以在靶基因中引入一新的限制性酶切位点。利用反向PCR扩增已知序列以外的未知序列，现已用该技术扩增已知目的启动子区序列。利用不对称PCR产生大量的单链DNA，用于核酸的序列测定。利用多重PCR同时扩增出多个核酸片段，以检测多种病原微生物等等。 1 2 连接酶链式反应(Ligase Chain Reaction,
LCR)
连接酶反应是Backman于1987年为检出靶基因序列中的点突变而设计发明的。Barany于1991年报道了耐热连接酶 Taq连接酶的发现及其在LCR中的应用，为LC R的实用化奠定了基础[3]。LC R识别点突变的特异性高于PCR，这是由耐热连接酶的特异性决定的[4]。若靶序列有点突变，引物不能与靶序列精确结合，缺口附近的核苷酸空间结构发生变化，连接反应不能进行，也就不能产生扩增产物。
LC R技术是利用DNA连接酶连接预先形成的DNA片段，经变性、退火和连接三个步骤的反应温度循环，从而使目标DNA大量扩增。LCR首先利用两对分别互补的寡核苷酸引物与变性的靶序列结合，然后DNA连接酶补平缺口，完成一个反应循环，连接产生的两个模板，都在下次循环中再作为连接模板，这样，经20~30次循环的反应就可产生百万拷贝的目的序列。
目前该方法主要用于点突变的研究与检测，微生物病原体的检测及定向诱导等，还可用于单碱基遗传病多态性及单碱基遗传病的产物诊断，微生物的种型鉴定和癌基因的点突变研究等。
1 3 链替代扩增(Strand displacement
amplification,SDA)
链替代扩增是恒温扩增DNA的一种新型方法，主要是依赖于限制性内切酶和DNA聚合酶两种酶的共同协作来完成[5]。由于链替代扩增所需的靶分子为单链DNA，同时靶分子还要与引物结合形成两端均为
5悬端的结构，所以在进行SDA反应前应先对靶分子进行处理。链替代扩增的原理是首先用含有HincII识别位点的SDA引物与单链靶分子结合，在5-3外切酶活性的DNA聚合酶的作用下，以dC TP、dGTP、dTTP、dATP[ S]( 磷酸硫酸化三磷酸腺苷)为底物聚合形成具有半磷酸硫酸化位点的DNA双链。用HincII切割未保护的引物链，而被修饰的靶片段则保持不动。这时再由DNA聚合酶在切口处启动延伸并取代下游部分，这种聚合过程又重新产生了一条新的可以被HincII打开切口的DNA单链，而靶DNA分子仍保持不动。这种打切口、聚合、取代的步骤不断循环反复，产生大量靶分子的互补链。
SDA的优点是灵敏性高，可快速扩增获得单链DNA分子，但SDA由于其靶序列准备的复杂性限制了其应用范围。最早采用SDA方法检测结核杆菌IS6110基因，首先将全染体或含有该基因的重组质粒进行一次RsaI酶切，得到的片段可用作SDA反应的靶分子。现已有研究工作者改进了靶分子准备程序，使其更有效。目前该方法已应用于细菌的检测、建立体外进化模型、核酸定量及芯片杂交等多个方面。
1 4 核酸依赖的扩增(Nucleic acid sequence based
amplification,NASBA)
tp01990年首次提出的由一对引物指导的连续均一的体外特异核苷酸序列等温扩增酶促过程。反应在42!进行，扩增速度与PCR一样快，在3小时内可扩增1000万倍[6]。
NASBA反应是由AMV反转录酶、RNA酶H、T7RNA聚合酶3种酶共同协作完成的，标准的NASBA反应体系除以上3种酶外，还应有脱氧核糖核苷三磷酸(dNTP)、核糖核苷三磷酸(NTP)、2个特殊的引物和适宜的缓冲液。其中引物I3端与靶序列互补,5端具有被T7RNA聚合酶识别的启动子序列，引物II的5端序列与靶RNA序列相同[7]。NASB A整个反应分为两相：非循环相和循环相。如开始用RNA靶序列，反应将如此进行：首先,5端含有RNA聚合酶启动子序列的引物I与靶序列复性，并由反转录酶催化产生一cDNA链，以RNase H降解新生成的双链螺旋中的RNA，这样
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第5期陈庆山等：核酸体外扩增技术
生成了带有启动子序列的cDNA，以上称为非循环相。然后，引物II与裸露的c DNA复性，进行第二链的合成，启动子序列变为双链。这时,RNA聚合酶可以合成一反义原靶序列的多个拷贝启动子序列。反过来，它们又可作为反应循环相中c DNA合成模板，继续合成反义原靶序列RNA。
NASB A的特点是操作简便，不需特殊仪器，不需温度循环，整个反应过程由3种酶控制，循环次数少，忠实性高。由于反应不需高温变性步骤，所以NASB A不会受到双链DNA的污染。同时由于外来双链DNA无T7启动子序列，不可能被扩增，这就大大提高了NASB A反应的特异性。NASB A均一地等温扩增特性扩大了它的应用范围，技术适于检测和定量特异RNA，并且用NASBA也可以应用于扩增双
河北科技师范学院学报
链DNA。
1 5 Q 复制
Q 复制是依赖于Q 复制酶(Q beta replicase)可以指数式放大重组DNA分子。Kacian等于1972年首次报道了Q 复制酶催化RNA模板的自我复制功能[8]。它能在常温30min，将其天然模板MDV 1RNA扩增至109。Q 复制酶是噬菌体Q 中RNA 指导的tRNA聚合酶,MDV 1RNA是Q 复制酶的天然模板。该酶是异源多聚体，由自身编码的亚基及3个宿主蛋白构成，这3个宿主蛋白为核糖体蛋白S1和延长因子Tu(EF Tu)和Ts[9,10]。
Q 复制酶有以下4个特点:(1)不需寡核苷酸引物的引导就可启动RNA的合成[11]。(2)能特异地识别RNA基因中由于分子内碱基配对而形成的特有的RNA折叠结构。(3)在大量寄主RNA存在的情况下，仍特异地复制病毒RNA。(4)在Q 复制酶天然模板MDV 1RNA的非折叠结构区插入一段短的核酸序列不影响该酶的复制，因而，如在此区插入待测序列，则其序列同样可被Q 复制酶扩增。
有的研究通过构建含有MDV 1RNA序列的重组体，在其特定位置插入待测序列，这样重组体的RNA分子被用作探针与互补的cDNA杂交，或作为RNA合成的模板得到大量扩增。该技术已应用在增加探针检测敏感性上。
1 6 转录介导的扩增(Transcription mediated
amplification,TMA)
转录介导的扩增是利用RNA聚合酶和反转录酶在等温条件下扩增目的DNA或RNA的扩增方法。转录介导的扩增是Kohne于1986年研究报道的[12]。
TMA系统由样本的制备、扩增和检测3部分组成。TMA扩增需要2个引物和2种酶:RNA聚合酶和反转录酶。一个引物带有RNA聚合酶的启动子序列。首先,5端有启动子的引物与目标片段结合，反转录酶催化合成cDNA链，形成RNA:DNA杂交体。由于反转录酶同时具有Rnase H的功用，水解掉杂交体中的RNA。另一引物与DNA单链杂交合成具有启动子序列的双链DNA模板,RNA聚合酶以此双链DNA为模板转录出与待检RNA互补的RNA链，这些RNA又进入下轮循环。
TMA操作简便，因不需要温度循环，只需在恒温器或水浴锅中进行就可以。TMA的主要特点是扩增效率高，在1小时内可将目的基因扩增百万倍以上。另一个特点是特异性高。最近研究表明，该方法用于HIV的定量检测，灵敏度高于RT PCR和bDNA方法[13]。TMA主要用于RNA扩增。
1 7 滚环复制(Rolling circle amplification,RC A)
滚环复制是一种新的扩增方法，既可以进行靶基因的扩增又可以用于信号放大扩增[14]。RCA分线性和指数扩增两种形式。线性RCA是引物结合到环状DNA上后，在DNA聚合酶的作用下被延伸，产物是
具有大量与环状DNA互补的重复序列的DNA单链。线性RCA只适用于环状核酸的扩增。例如环状病毒、质粒和环状染体。线性RC A 是产生与原始引物相连的单链扩增产物的唯一方法。
指数RC A与线性RC A相似，它采用了第二种引物。该引物序列与环状DNA序列完全一致。在RC A循环中，此引物与第一次线性RC A产物结合并在聚合酶的作用下延伸，其产物又作为第一种探针的模板，这样一来产物呈指数递增。指数RC A 也可用于非环状DNA的扩增。设计一个引物，其两端可结合到一段连续的序列上，并形成缺口，在连接酶的作用下，引物被连接成环状，此环状引物作为RCA的模板进行指数扩增。Thomas等[15]实验证实其灵敏度可达到10拷贝，在1h内可扩增107倍。该方法可直接应用于突变检测和SNP的检测。
2 信号放大扩增
随着生物学研究领域的不断拓展，常常会遇到对待检分子不能直接扩增，但又由于其浓度较低而
12中 国 生 物 工 程 杂 志第24卷
无法检测的情况，因此信号放大扩增对检测前不能进行直接扩增的低浓度分子的检测显得尤为重要。例如对蛋白质、脂类和糖类物质的检测。通过比较，信号放大扩增产生假阳性的频率要低于目标片段直接扩增。这就使信号放大扩增应用到更多的研究领域。
2 1 支链DNA信号放大系统(Branched D NA,
bDNA)
支链DNA信号放大系统的信号扩增是依据许多带有碱性磷酸酶标记的探针杂交结合到树枝状的DNA枝状体上实现的。bDNA技术首先采用带有特定寡核苷酸片段的固体平台，待测分子与这些寡核苷酸片段结合，然后再加入与待测片段杂交的探针。该探针结合有60~300分枝不等的寡核酸枝状体，最后碱性磷酸酶标记的探针杂交结合到这些树枝状核酸枝状体上，在碱性磷酸酶的发光底物1,2 二恶二酮的诱导下使其化学发光，通过对发光强度的检测对待测分子进行定量检测。
支链DNA信号放大系统的主要优点是高灵敏度、检测范围大和准确定量三方面[16]。如果体系构建正确，甚至可以对单分子进行有效检测。支链DNA信号放大系统已广泛应用于HIV、HCV和HB V 等人类疾病的检测。
2 2 侵染探针技术(Invader)
Invader分析是美国三波技术公司开发出来的，该技术使用一个耐热的、结构特异的内切核酸酶，它根据结构而不是序列在特殊位点上切割核酸分子。是一种等温非∀PCR#的DNA和RNA定性和定量检测方法[17]。可简单、快速、准确检测基因突变和单核苷酸多态性(SNPs)。
Invader体系包括两个特定的寡核苷酸片段作为探针，侵染探针和信号探针[18]。信号探针3端序列与目标片段完全结合杂交，其5端带有荧光标记并因不能与目标片段结合呈翼状突出。侵染探针和信号探针与目标DNA杂交重叠的部分(重叠至少一个碱基)产生特定结构。这种特定结构将被内切核酸酶识别并将信号探针突出的5端翼剪切，剪切后的信号探针与目标DNA解离。并有新的信号探针重新与目标DNA杂交结合，随后也被剪切解离。而在含荧光共振能量传递的通用报告系统(FRE T)的寡核苷酸探针上发生的第二次侵入裂解反应中，释放的5翼又充当了另一个侵入寡核苷酸，再次形成侵入结构。第二个侵入切割反应进一步放大靶特异性产物。FRET探针的5端标有染料Q着的淬灭基因F。切割下来的5 荧光素标记产物用荧光板读取器检测，其荧光强度与靶分子量成正比。
Invader体系可以直接从基因组DNA中检测目的基因，而无需进行PCR扩增。Invader方法方便快捷同时具有很高的灵敏度，经常用于实时监测。此外，该体系适用于大范围检测基因组单核苷酸多态性，因为碱基错配可抑制内切核酸酶的识别与剪切，用于基因突变的研究报道结果与等位基因特异性PCR一致[19]。
2 3 滚环复制(Rolling circle amplification,RC A)
线性滚环复制可以用于信号放大。当线性RC A被用于信号放大扩增时，可以做到固体状态下直接扩增，并可给产物准确定位[15]。Schweitzer 等[1]建立了免疫RC A，引物的5端标记有抗体，抗原抗体
反应后，加入RC A反应组分与环状DNA模板进行RCA，然后标记有荧光素的探针与RCA产物原位杂交，最后对荧光信号进行检测。该方法的灵敏度可达0 1pg ml。最近研究表明，线性RC A信号放大扩增已在微阵列方面得以应用。对于2D或3D的DNA阵列,RCA可将杂交信号或荧光标记探针信号放大104倍。实验证明，采用RC A的蛋白芯片对血清中I gE进行检测要优于传统的免疫阵列。
3 结 语
核酸分子体外扩增是生物技术研究的重要手段。随着科学的发展和研究目的的不同，出现了越来越多的核酸分子体外扩增技术。但目前看来，聚合酶链式反应(PC R)还是主导技术，在各类实验中起着重要的作用，大多数生物技术分析和研究还都将使用PCR技术。在病毒检测和遗传病点突变检测方面，连接酶链式反应(LCR)、支链DNA信号放大系统(bDNA)和侵染探针技术(Invader)有独到之处，可以弥补PCR技术的缺陷。核酸依赖的扩增(NASB A)和转录介导的扩增(TMA)可以用于快速准确检测和定量分析RNA,Q 复制可以用于检测目的DNA片段。总之，这些技术各有所长，可以满足不同研究的要求。因而在研究中要根据实验目的和现有条件，选择适当的扩增技术。
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Progress of Nucleic Acid Amplification Technologies
C HE N Qing shan LI U Chun yan LIU Ying xue LIU Hai yan C HE N Li jun
FU Rao SHAN Ji xun GUO Qiang ZHANG Li na
(Institute of s oybean research,Northeast Agricultural Universi ty,Harbin 150030,China)
Abstract Nucleic acid amplification is the base of the study of molecular biology.With the development of biotec hnology,more and more technology of nucleic acid amplification has been emerged.There are two kinds of nucleic acid a mplification based on the amplification characteristic of these technologies.One is the target a mplification,including Polymerase Chain Reaction(PC R),Strand displacement amplification(SDA),Ligase Chain Reaction(LCR),Nucleic acid sequence based a mplification(NASBA),Q replicase,Transcription mediated a mplification(TMA)and Rolling circle a mplification(RCA);the other is the signal amplification,including Branched DNA(bDNA)and Invader et al.The theories,characteristics and applications of these amplification technologies were introduced.
Key words Nucleic Acid Amplification Target Amplification Signal Amplification
14中 国 生 物 工 程 杂 志第24卷
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