防止物理因素的降解：1.尽量简化操作步骤，缩短提取时间，以减少变性机会。2.防止热变性，避免高温。一般0-4℃。3.防止机械剪切作用 动作轻缓；搅拌温和；加山梨醇等增加渗透压。 防止化学因素的降解：1.避免强酸强碱作用，抽提液pH要保持在4-10之间。2.保持提取液一定的离子强度，以调节核酸的溶解度和保持二级结构的稳定性。
防止核酸酶的降解
防止DNA酶的降解：通常加入酶的抑制剂、蛋白质的变性剂和去垢剂来实现。 1.加入金属离子螯合剂抑制DNA酶
2.去垢剂及某些RNase抑制剂，对DNA酶也有一定抑制作用。
防止RNA酶的降解：RNase很难抑制，且无处不在，汗液、唾液中均有。很耐热，80℃处理15分钟不能灭活。
操作注意事项：1.带一次性手套、口罩；2.器皿试剂高压灭菌或用DEPC（乙二基焦炭酸）处理。但含有Tris的试剂不宜用，因DEPC可与胺类迅速发生化学反应。3.尽早除去蛋白质（含RNase）,并加抑制剂。
常用的抑制RNase活性的方法有：
1.核糖核酸酶阻抑蛋白（RNasin,人胎盘中分离的一种蛋白）优点：效果好，不干扰反转录或mRNA在无细胞体系中的翻译。
使用注意事项：（1）置于含5mmol/L二硫苏糖醇（DDT）的50%甘油中，-20℃储存。（2）最大活性的发挥要求有巯基试剂。（3）冻融数次后应弃之不用。（4）在变性裂解哺乳动物细胞提取RNA的初始步骤中不宜使用，在其后RNA纯化步骤中应用。用酚抽提可除去蛋白质抑制剂，故纯化过程中应补加。
2．糖核苷复合物（vanadyl-ribinucleaside complex） 由氧钒（IV）离子和4种核糖中的任意一种形成的复合物，是一种过渡态类似物，它能与多种RNase结合并几乎能百分百地抑制RNA酶的活性。
缺点：强烈抑制mRNA在无细胞体系中的翻译。可用0.1%羟基喹啉的苯酚（用0.01mol/L E(pH>7.8)平衡）多次抽提除去。
3.硅藻土（Macaloid）:是一种粘土，能吸附多种RNA酶。用缓冲液以0.015%（W/V）的终浓度溶解细胞，这种粘土同它所吸附的RNA酶可在后续的RNA纯化过程中经离心除去。
4.皂土：一种无机物，与酶结合可使其失去活性。
5.DEPC(焦炭酸二乙酯)
6.肝素（heparin）
7.去垢剂 主要分为阴离子型去垢剂、阳离子型去垢剂和非离子型去垢剂三类，近几年又出现了双性离子去垢剂。其作用为：①溶解膜与质膜②使蛋白质变性与溶解③对RNase和DNase有一定的抑制作用④乳化剂 去垢剂的效果和作用时间有关，一般以高浓度、短时间为好，因为这样核酸分解较少。常用阴离子去垢剂：①SDS②LDS③Sarkosyl④DOC⑤4-氨基水杨酸钠⑥萘-1,5-二磺酸钠⑦三异丙基萘磺酸钠
8.胍类：常用的有盐酸胍和硫氰酸胍，蛋白质的强烈变性剂，能迅速溶解蛋白，导致细胞结构破碎，核蛋白（RNP）由于其二级结构的破坏而从核酸上解离下来。
9.RNA酶作用底物：加入小分子的RNA作为RNA酶的底物，可减轻对RNA的水解作用。
10.多胺（polyamine）:反应可逆，抑制不完全。
核酸的纯化主要方法：超离心（提纯和分离最常用的方法，又分为①沉降速度超离心②沉降平衡超离心ρ=1.660+（G+C）%，相似条件下核酸密度 ssRNA>dsRNA>ssDNA>dsDNA>tRNA和蛋白质环状DNA>线状DNA,DNA分子密度与构想有关，加入重金属AgHg）
核酸提取的一般步骤：1、破碎细胞（物理方法&化学法和生物学法：①去垢剂②溶菌酶③蛋白酶—目前三法相互组合使用）
核蛋白的解聚和蛋白质的去除：1.去垢剂法 2.有机溶剂法（1苯酚：有效地带白质变性剂，使用最多。它对核酸酶有一定的抑制作用，但对RNase却常常抑制不完全，且能溶解含polyA的mRNA。用饱和酚与氯仿可减轻这种现象，其中氯仿可使蛋白质变性并有助于液相惊天霹雳
与有机相的分离。同时加入适当的异戊醇（24:24:1）有助于消除抽提过程中的泡沫，使蛋白质层紧密，水相和有机相分层更好。酚的使用注意事项： 1）国外市售液化酚是清凉、无的，无须重蒸馏便可使用。（氧化后变粉红或黄，不能用） 2）国内出售的多为结晶酚，应在120℃用空气冷凝管进行重蒸馏，以去除氧化物。3） 酚的平衡：pH8.0缓冲液饱和酚，因为在酸性条件下DNA分配于有机相，因此使用前必须对酚进行平衡，使其pH在7.8以上。）
核酸的沉淀：核酸是水溶性的多聚阴离子，它们的钠盐和钾盐在多数有机溶剂包括乙醇-水混合物中不溶，但在中等浓度的单价阳离子（NaCl、NaAc、NH4Ac）下也不会被有机溶剂变性。因此常用乙醇、异丙醇等有机溶剂作核酸的沉淀剂。然后通过离心并按所需浓度重溶于适当的缓冲液中。 用乙醇、异丙醇等有机溶剂沉淀核酸应注意的因素：
苏小沫儿
1） 形成沉淀温度：几年前常规的乙醇沉淀在低温下（干冰-甲醇浴中）进行，现知已无必要。一般在0℃且没有载体的情况下，浓度低至20ng/ml的DNA也能形成沉淀。
| 广州登革热储存液（mol/L） | 终浓度（mol/L） |
乙酸铵 | 10.0 | 2.0-2.5 |
LiCl | 8.0 | 0.8 |
NaCl | 5.0 | 0.2 |
乙酸钠 | 3.0(PH5.2) | 0.3 |
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2）在沉淀混合液中，使用的单价阳离子的类型与浓度：最为常用的阳离子如表，其选择很大程度上取决于个人偏好。
* 乙酸铵（2.0-2.5mol/L）常用与减少dNTP的共沉淀，在2mol/L的乙酸铵存在下连续沉淀两次，可除去DNA制剂中99%的dNTP。
* 但因铵离子抑制T4噬菌体多核苷激酶，所以提取的核酸要用于核酸化时则不能用乙酸铵。
* LiCl用高浓度的乙醇沉淀核酸（如RNA）时，常用LiCl(0.8mol/L)。LiCl在乙醇中的溶解度很高而且不随核酸共沉淀。
* 因氯离子可抑制蛋白质合成的起始，也抑制依赖于RNA的DNA聚合酶的活性，故如沉淀的RNA用于无细胞翻译或反转录时，应避免使用LiCl。
*各种分子大小的RNA在高浓度的LiCl(0.8mol/L)中的溶解度各不相同，故可用LiCl(没有乙醇)选择性的纯化大分子RNA。
*NaCl:含有SDS的样品应使用NaCl(0.2mol/L)。这时该去污剂在70%乙醇中仍保持可溶。
*乙酸钠：DNA和RNA共沉淀大多是用乙酸钠（0.3mol/L,PH5.2）
*注：高浓度的磷酸盐（>1mmol/L）或高浓度的EDTA(>10mmol/L)缓冲液，不宜用于乙醇沉淀，因为这些物质可与核酸共沉淀。（可通过常规柱层析或离心层析除去）
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*沉淀极短的核酸小片段（<100个核苷酸）时，加入终浓度为0.01mol/L的MgCl2可改善沉淀效果。
异丙醇可选择性的沉淀DNA,而RNA不沉淀。
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其他杂质的去除：多糖、脂类和小分子物质，主要是去多糖：例如CTAB法；去多酚类物质：PVP,能与多酚类物质结合形成沉淀。
不同类型核酸的分离：
提DNA中去RNA，提RNA中去DNA：
1.根据在NaCl溶液中的溶解度差异分离
DNA : 1-2mol/L NaCl 溶解度大
0.14mol/L NaCl 溶解度小
RNA : 0.14mol/L NaCl 溶解度大
2.用酶解法： 比较有效
（1）RNase选择性的降解RNA。
RNase常含微量的DNase,必须预先加热除去（自消化）。
（2）DNase选择性的降解DNA
3.钙盐分步沉淀
在核酸溶液中加入1/10体积的10%CaCl2，使DNA和RNA均成为钙盐，再利用DNA钙盐在1/5体积乙醇中形成沉淀，而RNA钙盐不沉淀而分离。
4.异丙醇选择性的沉淀大分子DNA,可除去RNA
5.苯酚抽提法
（1）在酸性溶液中，以等体积的90%苯酚反复抽提RNA，可除去绝大多数DNA。
（2）也可在提取过程中用90%苯酚抽提而直接将RNA和DNA分离。（RNA在水层，DNA与蛋白质沉淀于酚层，提总RNA时现常用此法。因酸性条件下，DNA分配于有机相）
6.活性炭吸附法：吸附掉小分子RNA。
核酸制剂的保存
1、保存中主要问题，主要是防止变性和降解。①加入螯合剂，抑制DNase ②pH7-8，防止酸变性。③一定盐浓度，中和电荷，保持双键结构。
2、保存方法：
1DNA溶于TE溶液[10mmol/L Tris(三羟甲基氨基甲烷)-1mmol/L EDTA(Ph8.0)] -20℃保存，或SSC溶液（0.15mol/L NaCl-0.015mol/L柠檬酸钠）
2DNA置于75%乙醇中以沉淀形式储存于-20℃长期保存。
3RNA则可冰冻干燥或在含0.3mol/LNaAc的75%乙醇中以沉淀形式于-20℃长期保存。
核酸制剂纯度的初步鉴定
核酸在260nm附近有最大吸收值，据此特性可定性和定量检测核酸和核苷酸。蛋白质在280nm有一定吸收峰，利用核酸在260nm与280nm的吸光度（A）即光密度（D）比值（A260/A280），可判断核酸样品的纯度。
唐健生
纯DNA的A260/A280应大于1.8，纯的RNA应达到2.0。
纯的样品可以根据260nm下A值计算出含量：A值为1时，相当于：
50ug/mL 双螺旋 40ug/mL单链DNA 20ug/Ml 寡核苷酸
***核酸的光吸收值常比其各核苷酸成分的光吸收值之和少30%-40%，这是在有规律的双螺旋结构中碱基紧密地堆积在一起造成的，此现象成为DNA的减效应（hypochromic effect）。当核酸分子变性时，它在260nm处的吸收值便增大，此现象成为增效应（hypertchromic effect）。
核酸溶液的紫外吸收也可以以摩尔磷的吸光度来表示，摩尔磷即相当于摩尔核苷酸。
先测定出溶液的含磷量及紫外吸收值，然后求出摩尔磷吸光系数ε(P)。
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