抗坏血酸（维生素 C ）的测定方法（ 1）
在测定维生素C的国标方法中，荧光法为测定食物中维生素 C含量的第一标准方法，2、 4－二硝基苯肼法作为第二法。
一、荧光法
1．原理
样品中还原型抗坏血酸经活性炭氧化成脱氢型抗坏血酸后， 与邻苯二胺（OPDA反应生 成具有荧光的喹喔啉 （ quinoxaline ）,其荧光强度与脱氢抗坏血酸的浓度在一定条件下成正 比，以此测定食物中抗坏血酸和脱氢抗坏血酸的总量。
脱氢抗坏血酸与硼酸可形成复合物而不与 OPDA反应，以此排除样品中荧光杂质所产生的干
扰。本方法的最小检出限为 0.022 g/ml。
2．适用范围
GB12392-90 本方法适用于蔬菜、水果及其制品中总抗坏血酸的测定
3．仪器 3．1．实验室常用设备。
3.2.荧光分光光度计或具有 350nm及430nm波长的荧光计。
3． 3．打碎机。
4.试剂
本实验用水均为蒸馏水，试剂不加说明均为分析纯试剂。
（ 1）偏磷酸－乙酸液：称取 15g 偏磷酸，加入 40ml 冰乙酸及 250ml 水，搅拌，放置过夜使 之逐渐溶解，加水至 500ml。4C冰箱可保存 7〜10天。
（2）0.15 mol/L 硫酸：取 10ml 硫酸，小心加入水中，再加水稀释至 1200ml。 （ 3）偏磷酸－乙酸－硫酸液：以 0.15mol/L 硫酸液为稀释液，其余同 4.1. 配制。
（4） 50% 乙酸钠溶液：称取 500g乙酸钠（CH3COONS3H2O，加水至1000ml。 （5） 硼酸-乙酸钠溶液：称取 3g硼酸，溶于100ml乙酸钠溶液（4.4 ）中。临用前配制。
（6） 邻苯二胺溶液：称取 20mg邻苯二胺，于临用前用水稀释至 100ml。
（7） 0 . 04%百里酚蓝指示剂溶液：称取 0.1g 百里酚蓝，加 0.02mol/L 氢氧化钠溶液，在玻
璃研钵中研磨至溶解，氢氧化钠的用量约为 10.75ml ，磨溶后用水稀释至 250ml。
200g炭粉于1L 1+9盐酸中，加热回流 1~2h,过滤，用水洗至滤 110~120C烘箱中干燥，备用。
1mg/ml）:准确称取50mg国际标准化机构抗坏血酸，用溶液（4.1 ）溶于50ml容量
抗坏血酸标准使用液（100卩g/ml ）:取10ml抗坏血酸标准液，用偏磷酸 -乙酸溶液稀
释至100ml。定容前试pH值，如其pH> 2.2时，则应用溶液（4.3 ）稀释。
气瓶水压试验标准曲线的制备： | 取下述”标准”溶液（抗坏血酸含量 10卩g/ml ） 0.5、1.0、1.5和2.0ml |
| |
标准系列，取双份分别置于 10ml 带盖试管中，再用水补充至 2.0ml 。
5.操作步骤
5.1样品制备
福泽谕吉全部实验过程应避光。
称取100g鲜样，加100g偏磷酸-乙酸溶液，倒入打碎机内打成匀浆，用百里酚蓝指示 剂调试匀浆酸碱度。如呈红，即可用偏磷酸 -乙酸溶液稀释，若呈黄或兰，则用偏磷 酸-乙酸-硫酸溶液稀释，使其 pH为1.2。匀浆的取量需根据样品中抗坏血酸的含量而定。
当样品液含量在 40~100卩g/ml之间，一般取20g匀浆，用偏磷酸-乙酸溶液稀释至100ml, 过滤，滤液备用。
5.2氧化处理：分别取样品滤液及标准使用液各 100ml 于带盖三角瓶中，加 2g 活性炭，用 力振摇1mi n,过滤，弃去最初数毫升滤液，分别收集其余全部滤液，即样品氧化液和标准 氧化液，待测定。
5.3各取 5ml 海森堡标准氧化液于 2个 50ml 容量瓶中,分别标明 "标准"及"标准空白 "。
5.4各取 5ml 样品氧化液于 2个 50ml 容量瓶中,分别标明 "样品"及"样品空白 "。
5.5于”标准空白”及"样品空白”溶液中各加5ml硼酸-乙酸钠溶液，混合摇动 15min，用水 稀释至50ml，在4 C冰箱中放置2h,取出备用。
5.6于”样品”及”标准”溶液中各加入5ml50%乙酸钠溶液，用水稀释至 50ml，备用。
5.7 荧光反应
取”标准空白”溶液，”样品空白”溶液及(5.6 )中”样品"溶液各2ml，分别置于10ml带 盖试管中。在暗室中迅速向各管中加入 5ml邻苯二胺，振摇混合，在室温下反应 35min,用
激发光波长338nm发射光波长420nm测定荧光强度。标准系列荧光强度分别减去标准空白 荧光强度为纵坐标, 对应的抗坏血酸含量为横坐标, 绘制标准曲线或进行相关计算, 其直线 回归方程供计算时使用。
6.计算
X= (cx V/m)x FX (100/1000)
式中： X 样品中抗坏血酸及脱氢抗坏血酸总含量, mg/100g；
c------由标准曲线查得或由回归方程算得样品溶液浓度， 卩g/ml ;
m 试样质量, g；
F 样品溶液的稀释倍数；
V 荧光反应所用试样体积, ml。
例：测定每一制备溶液的荧光强度。 用标准溶液每 ml含2.5卩g、5.0卩g、7.5卩g及10.0卩g,
各标准浓度管读数减去相应的标准空白读数的各平均值做标准曲线。
由样品液读数减去样品液空白读数之值，从标准曲线上查得相应的抗坏血酸( 卩g/ml ),按
取样量及稀释率计算样品中抗坏血酸的含量。
如：取制备好的辣椒样品 2.138g，稀释到100ml，氧化后分别取10ml滤液稀释到50ml
样品读数为 23.34 ，样品空白读数为 3.188，样品读数减去样品空白读数为 20.152 ，查荧光 标准曲线相当标准抗坏血酸的 2.23卩g。
2.23x100x 50x 100 = 52 ( mg/100g) 2.138x 10 x1000
7.注意事项
7.1大多数植物组织内含有一种能破坏抗坏血酸的氧化酶, 因此, 抗坏血酸的测定应采用新
鲜样品并尽快用偏磷酸 -醋酸提取液将样品制成匀浆以保存维生素 C。
7.2某些果胶含量高的样品不易过滤,可采用抽滤的方法,也可先离心,再取上清液过滤。
7.3活性炭可将抗坏血酸氧化为脱氢抗坏血酸,但它也有吸附抗坏血酸的作用,故活性炭用
量应适当与准确，所以，应用天平称量。我们的实验结果证明，用 2g活性炭能使测定样品
中还原型抗坏血酸完全氧化为脱氢型,其吸附影响不明显。
二、 2， 4-二硝基苯肼法
1．原理
总抗坏血酸包括还原型、 脱氢型和二酮古乐糖酸。 样品中还原型抗坏血酸经活性炭氧化为脱 氢抗坏血酸，再与 2， 4-二硝基苯肼作用生成红脎，脎的含量与总抗坏血酸含量成正比， 进行比测定。
2．适用范围
GB12392-90 本方法适用于蔬菜、水果及其制品中总抗坏血酸的测定。
3.仪器
3.1恒温箱：37 ±）.5 C
3.2可见 -紫外分光光度计
3.3打碎机
4．试剂 本实验用水均为蒸馏水，试剂纯度均为分析纯。
4.14.5mol/L硫酸：谨慎地加250ml硫酸（比重1.84）于700ml水中，冷却后用水稀释至 1000ml。
4.285%硫酸：谨慎地加 9））ml 硫酸（比重 1.84）于 1））ml 水中。
4.32%2， 4-二硝基苯肼溶液：溶解 2g 2， 4-二硝基苯肼于 100ml4.5mol/L 硫酸内，过滤。
不 用时存于冰箱内，每次用前必须过滤。
4.42%草酸溶液：溶解
4.51%草酸溶液：稀释
4.61%硫脲溶液：溶解
4.72%硫脲溶液：溶解
20g草酸于700ml水中，稀释至 1000ml。500ml 2%草酸溶液到 1000ml。
5g 硫脲于 500ml 1% 草酸溶液中。
10g硫脲于500ml1%草酸溶液中。
4.8 1mol/L 盐酸：取 100ml 盐酸，加入水中，并稀释至 1200ml。
4.9活性炭：将100g活性炭加到750ml 1mol/L盐酸中，回流1~2h，过滤，用水洗数次，至 滤液中无铁离子（Fe3+）为止，然后置于110 C烘箱中烘干。
4.10 标准
（1）抗坏血酸标准溶液（1mg/ml）:溶解100mg法拉第筒纯抗坏血酸于 100ml 1%草酸溶液中。
（ 2）标准曲线绘制
加1g活性炭于50ml标准溶液中，摇动 1min，过滤。
取10ml滤液放入500ml容量瓶中，加5.0g硫脲，用1%草酸溶液稀释至刻度。抗坏血酸浓 度为20卩g/m。
取 5， 10， 20， 25， 40， 50， 60ml 稀释液，分别放入 7 个 100ml 容量瓶中，用 1%硫脲溶液 稀释至刻度，使最后稀释液中抗坏血酸的浓度分别为 1 , 2, 4, 5, 8, 10及12卩g/m。
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