碱性蛋⽩酶及各种蛋⽩酶活⼒测定⽅法及测定有感
因长期测定碱性蛋⽩酶酶活⼒与⾓蛋⽩酶活⼒与胶原酶活⼒和弹性蛋⽩酶活⼒，碱性蛋⽩酶活⼒测定还好，因有国家标准，测定按照国标来便可⼤⼤减少误差。其余酶活⼒测定过程中因⽆统⼀标准且底物差异⼤，导致长期酶活⼒测定的混乱，各种酶活⼒测定⽅法与各种试剂添加，最后实际测定的酶活⼒只能仅作参考。 以下是各种蛋⽩酶活⼒测定⽅法及标曲绘制：
碱性蛋⽩酶测定⽅法
根据国标GB/T 23527-2009 附录B 蛋⽩酶活⼒测定福林法
以下是⽅法
碱性蛋⽩酶的测定⽅法参考 GB/T 23527-2009 附录 B 中福林酚法进⾏，即 1 个酶活⼒单位（U/mL）定义为 1 mL 酶液在40℃、pH= 10.5 条件下反应 1 min ⽔解酪蛋⽩产⽣ 1 µg 酪氨酸所需要的酶量，主要步骤如下。 2.2.6.1 标准曲线的绘制
（1）L-酪氨酸标准溶液：按表 2-6 配制。
表 2-6 L-酪氨酸标准溶液配置表
Table 2-6 L-Tyrosine standard solution form
管号酪氨酸标准溶液的浓度/
（µg/mL）
取 100 µg/mL 酪氨酸标准
溶液的体积/（mL）
取⽔的体积/
（mL）
0 0 0 10
1 10 1 9
2 20 2 8
3 30 3 7
4 40 4 6
topgamer5 50 5 5
林树森简历
（2）分别取上述溶液各 1.00 mL，各加 0.4 mol/L 碳酸钠溶液 5.0 mL，福林试剂使⽤
液 1.00 mL，置于 40 ℃±0.2 ℃⽔浴锅中显⾊ 20 min，⽤分光光度计于波长 680 nm，10
mm ⽐⾊⽫，以不含酪氨酸的反应管作为空⽩，分别测定其吸光度值，以吸光度值 A 为纵坐标，酪氨酸浓度 C 为横坐标，绘制 L-酪氨酸标准曲线。
图 2-1 L-酪氨酸标准曲线
Fig. 2-1 L-tyrosine standard curve
根据作图或⽤回归⽅程计算出当吸光度为 1 时的酪氨酸的量（µg），既为吸光度常数 K 值。其 K 值应在 95-100 范围内。上图所⽰标准曲线符合要求，可⽤于下⼀步实验。
2.2.6.2 测定⽅法
（1）计算⽅法
X = A × K × 4 / 10 × n = 2 / 5 × A × K × n 式（2-1）
马基雅维利式中，X —样品的酶活⼒，µ/g；
A —样品平⾏实验的平均吸光度；
K —吸光常数；
4 —反应试剂的总体积，mL；
10—反应时间 10 min，以 1 min 计；
n —稀释倍数。
（2）测定⽅法
①先将⼲酪素溶液放⼊ 40 ℃±0.2 ℃恒温⽔浴中，预热 5 min。
②按下列程序操作，进⾏测定。
于 680 nm 波长，⽤ 10 mm ⽐⾊⽫测其吸光度。
酶液1.00 mL 酶液1.00 mL
预热2 min 预热2 min
三氯⼄酸2.00
⼲酪素1.00 mL mL
混匀混匀
保温10 min
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⼲酪素1.00 mL 三氯⼄酸2.00 mL 混匀混匀
10000 r/min
10000 r/min 离⼼2 min
离⼼2 min
滤液1.00 mL 滤液1.00 mL
加碳酸钠溶液5.00 加碳酸钠溶液mL 5.00 mL
加福林试剂1.00 mL 加福林试剂1.00 mL 显⾊20 min 显⾊20 min
⾓蛋⽩酶活⼒的测定
1、⾓蛋⽩酶活⼒测定⽅法
试剂和溶液：
a. 硼酸缓冲溶液（pH 10.5）：称取硼酸钠 9.54 g，氢氧化钠 1.6 g，加⽔⾄ 900 mL，搅拌均匀。⽤ 1 mol/L 盐酸溶液或 0.5 mol/L 氢氧化钠溶液调整 pH=10.5±0.05，
定容⾄ 1000 mL。
b. 硼酸缓冲溶液（pH 9.5、11.5）：称取硼酸钠 9.54 g，加⽔⾄ 800 mL，⽤氢氧化钠溶液调整 pH=9.5±0.05 或
pH=11.5±0.05，定容⾄ 1000 mL。
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c. 10%三氯⼄酸：10 g 三氯⼄酸，加⽔⾄ 100 mL。
d. 0.5%⽺⽑⾓蛋⽩溶液：取 0.5g ⽺⽑⾓蛋⽩加⼊ 100ml 硼酸缓冲液溶解
测定⽅法：
取 1 mL 酶液（0.1 g 酶粉⽤对应 pH 缓冲液溶解离⼼，取上清液适当稀释），取 4 ⽀具塞试管中，空⽩加 1mL 酶液、2 mL 0.5%⽺⽑⾓蛋⽩溶液（pH10.5、硼酸缓冲液溶解）、2 mL 10 %三氯⼄酸，对照加⼊ 1ml 酶液和 2ml ⾓蛋⽩溶液，在40℃恒温⽔浴锅中反应1 h 后对照加2 mL 10 %三氯⼄酸终⽌反应，在10000 r/min 离⼼ 10 min，取上清液，过滤，在 280 nm 处测吸光度。（使⽤⽯英⽐⾊⽫）酶活定义：1 ml/1 g 酶在该反应体系下对照相对于空⽩样 A280nm 吸光每升⾼ 0.01 为 1
unit（U）。X=(A280-A0)×100×N
N 为稀释倍数
胶原蛋⽩酶活⼒的测定
标曲的绘制
取11⽀试管分别标号，向每⽀试管中分别加⼊0、0.05、0.1、0.15、0.2、
0.25、0.3、0.35、0.4、0.45、0.5 m L 的0.75umol/ml 的标准⽢氨酸溶液，并⽤⽔补⾜⾄0.5 mL，各加⼊0.5 ml⼄酸-⼄酸钠缓冲液（pH5.4）充分混合，最
后加⼊0.5m L 茚三酮显⾊液，充分混合。⽤试管盖盖住，在100℃下⽔浴加热 10 min，冷却放置10min，加⼊4.5 m L⼄醇（60%，v/v）进⾏稀释，在570nm 下⽐⾊。
吸光值与⽢氨酸浓度标准曲线
1
0.9 0.8y = 1.2122x + 0.0135 R2 = 0.9955
0.7
0.6
0.5
0.4
0.3
0.2
0.1
豫公网安备41160202000603
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