第三节水溶性维生素的测定
水溶性维生素B1、B2和C，广泛存在于动植物组织中，饮食来源充足，但由于它们本身的水溶性质，除满足人体生理、生化需求外，任何多余量都会从机体中排出。为避免缺乏，需要经常由饮食来提供。
水溶性维生素都易溶于水，而不溶于苯、乙醚、氯仿等大多数有机溶剂。在酸性介质中很稳定，既使加热也不破坏；但在碱性介质中不稳定，易于分解，特别在碱性条件下加热，可大部分或全部被破坏。它们易受空气、光、热、酶、金属离子等的影响；维生素B2对光，特别是紫外线敏感，易被光线破坏；维生素C对氧、铜离子敏感，易被氧化。
由于水溶性维生素具有上述特性，测定水溶性维生素时，一般都在酸性溶液中进行前处理。维生素B1、B2通常采用盐酸水解，或再经淀粉酶、木瓜蛋白酶等酶解作用，使结合态维生素游离出来，还可用活性人造浮石、硅镁吸附剂等进行纯化处理。 测定水溶性维生素常用高效液相谱法、荧光法、比法和微生物法等。 一、维生素B1的测定(荧光法，GB/T5009.84—2003)
维生素B1又名硫胺素、抗神经炎素，通常以游离态，或以焦磷酸酯形式存在于自然界。在酵母、米糠、麦胚、花生、黄豆以及绿蔬菜和牛乳、蛋黄中含量较为丰富。动物组织不如植物含量丰富。 维生素B1在水中溶解度较大，在酸性溶液中较稳定，在碱性溶液中加热极易分解。
近年来对利用带荧光检测器的高效液相谱测定法进行了许多研究，并应用于实际试样测定。这里我们主要介绍荧光法（参考GB/T 5009.84-2003 食品中硫胺素(维生素B1)的测定）
（一）荧光法
1．原理
试样在酸性溶液中加热，提取维生素B1，经蛋白分解酶处理，使维生素B1成为游离型。再经层析柱纯化，去除荧光淬灭物质，同时浓缩，用碱性铁溶液将其氧化成硫素，在紫外线下，硫素发出荧光，再给定的条件下以及没有其他物质干扰时，此荧光之强度与硫素量成正比即与溶液中维生素B1量成正比。如试样中含杂质过多，应经过离子交换
剂处理，使硫胺素与杂志分离，然后以所得溶液做测定。
2．试剂
⑴ 盐酸（0.1mol/L）：8.5mL浓盐酸（相对密度1.19或1.20）用水稀释至1000mL；
⑵核冬天 盐酸（0.3mol/L）：25.5mL浓盐酸用水稀释至1000mL；
⑶ 乙酸溶液：30mL冰乙酸用水稀释至1000mL；
⑷ 氢氧化钠溶液（150g/L）：15g氢氧化钠溶于水中稀释至100mL；
⑸ 无水硫酸钠；
⑹ 乙酸钠溶液（2mol/L）：164g无水乙酸钠溶于水中稀释至1000mL；
⑺ 氯化钾溶液（250g/L）：250g氯化钾溶于水中稀释至1000mL；
⑻ 酸性氯化钾溶液（250g/L）：8.5mL浓盐酸用25%氯化钾溶液稀释至1000mL；
⑼ 1%铁溶液（10g/L）：1g铁溶于水中稀释至100mL。放于棕瓶内保存；
⑽ 碱性铁溶液：取4mL 10g/L铁溶液，用150g/L氢氧化钠溶液稀释至60mL。用时现配，避光使用；
⑾ 正丁醇：需经重蒸馏后使用；
⑿铝板带 淀粉酶和蛋白酶；
⒀ 活性人造浮石：称取200g 40目～60目的人造浮石，以10倍于其容积的热乙酸溶液搅洗2次，每次10min；再用5倍于其容积的250g/L热氯化钾溶液搅洗15min；然后再用稀乙酸溶液搅洗10min；最后用热蒸馏水洗至没有氯离子。于蒸馏水中保存；
⒁ 硫胺素标准贮备液（0.1mg/mL）：准确称取100mg经氯化钙干燥24h的硫胺素，溶于0.01mol/L盐酸中，并稀释至1000mL。于冰箱中避光保存； ⒂ 硫胺素标准中间液（10μg/mL）：将硫胺素标准贮备液用0.01mol/L盐酸稀释10倍。此溶液每毫升相当10μg硫胺素。于冰箱中避光可保存数月；
⒃ 硫胺素标准使用液（0.1mg/mL）：将硫胺素标准中间液用水稀释100倍，用时现配；
⒄ 溴甲酚绿溶液（0.4g/L）：称取0.1g溴甲酚绿，置于小研钵中，加入1.4mL0.1mol/L氢氧化钠研磨片刻，再加入少许水继续研磨至完全溶解，用水稀释至250mL。
3．仪器
⑴ 电热恒温培养箱；
⑵ 荧光分光光度计；
⑶ Maizel-Gerson反应瓶；
⑷ 盐基交换管。
4． 操作步骤
⑴ 试样制备
试样准备
样品采集后用匀浆机打成匀浆保存于低温冰箱中冷冻，用时将其解冻后使用。干燥试样要将其尽量粉碎后备用。 提取
准确称取适量试样（估计其硫胺素含量约为10μg～30μg,，一般称取2g～10g试样）置于100mL三角瓶中，加入50mL0.1mol/L或0.3mol/L盐酸使其溶解，放入高压锅中加热水解，121℃30min，凉后取出。
用2mol/L乙酸钠调pH值为4.5（以0.4g/L溴甲酚绿为外指示剂）。
按每克试样加入20mg淀粉酶和40mg蛋白酶的比例加入淀粉酶和蛋白酶。于45℃～50℃温箱过夜保温（约16h）。
凉至室温，定容至100mL，然后混匀过滤，即为提取液。
净化
用少许脱脂棉铺于盐基交换管的交换柱底部，加水将棉纤维中气泡排出，再加约1g活性人造浮石使之达到交换柱的1/3高度。保持盐基交换管中液面始终高于活性人造浮石。
用移液管加入提取液20mL～60mL（使通过活性人造浮石的硫胺素总量约为2μg～5μg）。
加入约10mL热蒸馏水冲洗交换柱，弃去洗液。如此重复三次。
加入20mL250g/L酸性氯化钾（温度为90℃左右），收集此液于25mL刻度试管内。冷至室温，用250g/L酸性氯化钾定容至25mL，即为试样净化液。
重复上述操作，将20mL硫胺素标准使用液加入盐基交换管以代替样品提取液，即得到标准净化液。
氧化
将5mL试样净化液分别加入A、B两个反应瓶。
在避光条件下将3mL150g/L氢氧化钠加入反应瓶A，将3mL碱性铁溶液加入反应瓶B，振摇约15s，然后加入10mL正丁醇；将A、B两个反应瓶同时用力振摇1.5min。
重复上述操作，用标准净化液将代替试样净化液。
静置分层后吸去下层碱性溶液，加入2g～3g无水硫酸钠使溶液脱水。
⑵ 测定
荧光测定条件：
激发波长365nm；发射波长435nm；激发波狭缝5nm；发射波狭缝5nm。
依次测定下列荧光强度：
a. 试样空白荧光强度（试样反应瓶A）；
b. 标准空白荧光强度（标准反应瓶A）；
c. 试样荧光强度（试样反应瓶B）；
d. 标准荧光强度（标准反应瓶B）。
5．结果计算
式中 X—样品中硫胺素含量，mg/100g；
U—样品荧光强度；
Ub江西省禁毒条例—样品空白荧光强度；
S—标准荧光强度；
Sb—标准空白荧光强度；
c—硫胺素标准使用液浓度，μg/mL；
V—用于净化的硫胺素标准使用液体积，mL；
除铁V1—样品水解后定容之体积，mL；
V2—样品用于净化的提取液体积，mL；
m—样品质量，g；
100/1000—样品含量由μg/g换算成mg/100g的系数。
6．说明及注意事项
⑴ 一般食品中的维生素B1游离型的，也有结合型的，即与淀粉、蛋白质等结合在一起的，故需用酸或酶水解，是结合型维生素B1成为游离型，再采用此法测定。一般淀粉酶含有维生素B1要用白土吸附去除，但需要迅速处理，否则酶活性降低。
⑵ 谷物类物质不需酶分解，样品粉碎后用250g/L酸性氯化钾直接提取。
⑶ 样品与铁溶液混合后，所呈现的黄应至少保持15s，否则应再滴加铁溶液1~2滴，因样品中含有还原性物质，而铁用量不够时，硫胺素氧化不完全，但过多的铁又会破坏硫胺素，其用量应恰当。
⑷ 紫外线破坏硫胺素，因此硫胺素形成后要迅速测定并力求避光操作。
⑸ 加热酸性KCL时不能使其沸腾，热KCL滤速较快，而不沸则是使其不至因过饱和而在洗涤中结晶析出阻塞交换柱。
⑹ 氧化中加铁是整个实验的关键，对每个样品所加试剂的次序、快慢、振摇时间等都必须尽量一致，尤其是用正丁醇提取硫素时必须保证准确振摇90s。
（二）高效液相谱法(HPLC)
1．原理
维生素B1测定通常采用反相键结合相谱法进行分离，利用紫外检测器或荧光检测器检测。利用荧光检测器检测时，应首先使从样品中提取出来的维生素B1氧化成硫素，然后转入正丁醇或异丁醇中，再进行HPLC分析。HPLC法快速、简便、准确、灵敏度高。
2．试剂
⑴ 0.0025mol/L磷酸盐缓冲溶液（PH7.4）；
⑵ 流动相：以磷酸盐缓冲液80份和乙腈20份相互混合而成；
⑶ 碱性溶液：吸收97mL150g/LNaOH溶液加入3mL10g/L铁相互混合而成；
⑷ 维生素B1标准溶液：用0.01mol/L盐酸溶液将符合药典的盐酸硫胺素配制成100μg/mL维生素B动量矩1标准溶液；
⑸ 维生素B1标准使用溶液：取维生素B1标准溶液2mL，用重蒸馏水定容至100mL，最终浓度为2μg/mL；
⑹ 混合酶溶液：根据酶的活度和活力，用两房退市2mol/LCH3COONa溶液取适量的淀粉酶和木瓜蛋白酶配制成各3%的浓度。
3．仪器
⑴ 液相谱仪（配荧光分光检测器和记录仪）；
⑵ 微量注射器（5、10μL微量注射器）；
⑶ 实验室常用设备。
4．操作步骤
⑴ 样品处理
将固体样品粉碎后过20目筛备用。肉类及水产品样品经捣碎机捣碎。果蔬类样品也经捣碎后备用。
称取样品1.00g（维生素B1含量不低于0.5μg）于50mL棕容量瓶中，加入35mL0.1mol/L盐酸溶液，在超声波浴中处理3min或转动摇动，在高压灭菌器内于121℃、20～30min或者置于沸水中加热30min，然后轻摇数次。取出，冷却至40℃以下，分别加入2.5mL混合酶液，摇匀，置于37℃下过夜或于42～43℃加热4h，冷却，用水定容至50mL,样液经3000r/min的速度离心后过滤，取约10mL滤液备用。
取上述滤液5mL于60mL分液漏斗中，边振边沿分液漏斗壁加入3mL碱性铁溶液，继续振摇10s，立即加入8mL异丁醇，并猛烈振摇45s,静置分层后，弃去水层。有机相通过无水硫酸钠小柱，收集待测溶液维生素B1。
维生素B1标准使用溶液：分别取0.00、0.25、0.50、1.00、2.00和4.00mL维生素B1于50m
L的棕容量瓶中，再加入与样品等量的0.1mol/L盐酸溶液，以下操作方法与样品处理相同。
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