2012年10月内蒙古科技与经济Octo ber2012 第19期总第269期Inner M o ngo lia Science T echnolo gy&Economy N o.19T o tal N o.269膜片钳技术结合全内反射荧光成像技术 霍夫曼系数
维力斯
(中南民族大学电子信息工程学院，湖北武汉 430074)
摘 要：介绍了膜片钳和全内反射荧光成像的工作原理、实验技术，以及这两种技术的结合在单细胞胞吐研究中的应用，并对其发展前景进行了展望。
关键词：生物物理学；膜片钳技术；全内反射荧光成像技术
中图分类号:Q6-33 文献标识码:A 文章编号:1007—6921(2012)19—0096—03TSL2550
生物物理学(Biophysics)是生物学与物理学相结合的一门交叉学科，是生命科学的重要分支，其应用现代物理学的实验方法和测量技术，并结合化学、电子学等技术，阐明生物在一定的空间、时间内相关物质、能量与信息的运动规律。生物物理技术根据生命机体从微观到宏观的不同水平可分为分子、细胞、组织和器官生物物理技术；以物理学分支或实验技术各自对生命机体的研究，又可以划分为生物电、生
方位角物磁、生物声、生物光等技术。目前，在生物物理学研究中，最常用的技术方法主要有功能分析技术[1～3]和形态分析技术[4,5]，这两类技术各有优缺点。
目前，在生物物理学的研究中，膜片钳技术和全内反射荧光成像技术分别是两种最常用的功能分析和形体分析技术。膜片钳技术可以获得生物信号发生、转导的信息，但无法得知生物信号发生源的蛋白表达和结构变化。全内反射荧光成像技术能够方便、准确地观察、定位细胞内外结构变化及蛋白在细胞内的表达，但是无法对生理变化时的组织及细胞进行同步信号变化(如生物电信号)分析。因此，将功能分析与形体分析相结合，成为生物物理技术发展的重要方向。下面笔者对以上两种技术，及这两种技术的结合在单细胞胞吐活动研究的应用做一介绍。
1 膜片钳技术
1976年德国马普生物物理研究所Neher和Sakm ann创建了膜片钳技术(pat ch clamp recor ding t echnique)[6～8]。膜片钳技术可以记录通过离子通道的离子电流来反映细胞膜单一的或多个的离子通道的分子活动。它为从分子水平了解生物膜离子通道的门控动力学特征、选择性以及通透性等膜信息，提供了最直接的手段。这一伟大的贡献，使Neher和Sakmann获得1991年度的诺贝尔生理学与医学奖。膜片钳技术自其发明以来，被广泛用于生物学、生理学、生物化学、药理学等多种学科的基础研究中，并同其他许多技术如基因克隆(g ene clo ning)等并驾齐驱，共同在生命科学领域发挥了巨大 的作用，成为生命科学中主要研究方法之一，给生命科学研究带来了强大的推进力。1.1 膜片钳技术原理
四甲基联苯胺
膜片钳技术运用玻璃微电极接触细胞膜，以千兆欧姆以上的阻抗使之对接，与微电极尖端开口处相接的细胞膜小片区域(膜片)与其周围在电学上形成分隔，在此基础上固定电位，对此膜片上的离子通道的离子电流(pA级)进行检测和记录。通过观测膜片区域离子通道开放和关闭的电流变化，可直接得到各种离子通道开放的电流幅值分布、开放几率、开放时程分布等功能参量，并分析它们与膜电位、离子浓度等之间的关系。玻璃微电极尖端与细胞膜之间形成的高阻抗封接是膜片钳技术实现膜电流固定的关键步骤，阻抗数值可达10G ～100G 。
由于此阻值非常高，故基本上可看成绝缘，上面的电流可近似于零，形成高阻抗封接主要有氢键、范德华力、盐键等。此封接不仅电学上近乎绝缘，在机械上也是比较牢固的。
肌球蛋白另外，高阻抗封接技术还大大降低了电流记录的背景噪声，从而提高了时间、空间及电流分辨率，如时间分辨率可达10 s，空间分辨率可达1 m2，电流分辨率可达10A～12A。膜片钳技术的核心部分是膜片钳放大系统，包括3个部分：膜片钳放大器(Amplifier)、AD/DA转换器(Digit izer)和数据采样与分析软件(Soft w are)，它们共同完成电流的采样、数据的处理和分析。
1.2 膜片钳记录形式
高阻封接问题的解决不仅改善了电流记录性能，还随之出现了多种研究通道电流的膜片钳方式，即细胞贴附模式(cell-at t ached m ode或on-cell m ode)、膜内面向外模式(inside-out m ode)、膜外面向外模式(outside-out mode)、常规全细胞模式(convent ional w ho le-cell mode)和穿孔膜片模式(perf orat ed patch mode)。根据不同的研究目的，可利用不同的膜片钳记录形式。
以上提到的4种膜片钳记录形式都是通过一根电极对膜片或细胞进行电压钳制，但相同的电极电压所造成的钳制水平不同，以Vp代表电极电位, Vm代表膜电位，则：细胞贴附式Vm=细胞静息电
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收稿日期:2012-08-17
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