收稿日期:2000-2-29
作者简介：康华光(1925～)，教授
文章编号:1000-6974(2000)03-0155-06
[膜片钳技术(一)]
本讲座介绍现代电生理研究的基本方法———膜片钳技术，共分四讲，内容包括：细胞电生理与膜片钳技术，单通道和全细胞记录技术，细胞分泌活动的实时监测技术以及细胞内钙离子浓度的测量和钙信号。全讲座由武汉华中理工大学生物物理与生物化学研究所康华光教授组织撰写和定稿。 —编者—
细胞电生理与膜片钳技术
康华光
华中理工大学生物物理与生物化学研究所 (湖北，武汉,430074)
提要 本讲座介绍细胞电生理的基本知识及其基本方法。包括细胞的简单结构、细胞膜的化学组成和生 物电信号的产生机制。膜片钳技术是现代电生理研究的基本方法，它涉及实验系统的组建和实验过程中的关键技术。
关键词 细胞电生理；生物电信号；膜片钳技术 中图分类号:Q6-33 文献标识码:A
身毒丸
Cellular E lectrophysiology and P atch Clamp T echnique
K ANG Hua -guang
Huazhong University of Science and T echnology
Abstract The fundamentals of cellular electrophysiology and its basic method are described here.The simply fied
structure of the cell ,the chemical constitutes of the membrane ,and the mechanism of the bioelectric signal generation are in 2cluded.The patch clamp is the fundamental methodology in m odern electrophysiology research.It is closely related to the construction of the laboratory setup and the key technique in experimental procedure.
K dy Words cellular electrophysiology ;bioelectric signal ;patch clamp technique
细胞是动物和人体的基本组成单元。细七彩魔方
胞外围有一层薄膜，彼此分离又互相联系。细胞间与细胞内的通信，依靠其膜上的离子通道来进行。离子和离子通道是细胞兴奋性的基础，亦即产生生物电现象的基础。生物电信号通常是用电学或电子学方法进行测量，形成一门细胞电生理学(electrophysi 2ology )，用以揭示细胞的生理过程。早期的研究多使用双电极电压钳技术作胞内记录，自
40年代末细胞膜和离子学说建立以来，细胞
电活动的研究逐渐深入。在1976～1981年期间，两位德国细胞生物学家Erwin Neher 和Bert Sakmann 所开创的膜片钳技术(Patch clam p technique )为细胞生理学的研究带来了
一场革命性的变化，因而两位科学家于1991年荣获诺贝尔生理学或医学奖。
膜片钳技术是以微弱电流信号测量为基础的，利用玻璃微电极与细胞膜封接可测量多种膜通道电流，其值可小到皮安(pA ,10-12A )量级，是一种典型的低噪声测量技术，达 到当今电子测量的极限。
膜片钳技术发展至今，已成为现代细胞
电生理研究的常规方法，它不仅可以作为基础生物医学研究的工具，而且在间接或直接为临床医学服务方面，正在产生积极的效果。1 细胞的结构及细胞膜的化学组成1.1 细胞的结构
所有动物细胞都由一层薄膜所包围，这就是细胞膜或称质膜(plasma membrane )(图1)。可以想像，细胞膜是一种具有特殊结构和功能的半透性膜。它一方面允许某些物质有选择性地通过，但又能较严格地保持细胞内物质成分的稳定。细胞内部也存在着类似细胞膜的膜性结构，它们构成胞内的细胞器，如线粒体、内质网等。这就形成细胞器之间、
细胞器与胞浆之间有可能保持化学组成上的相对独立，从而可进行不同的功能活动。
图1 细胞的简化结构
1.2 细胞膜的化学组成
电镜观察表明，多种细胞的膜都具有类
似的结构，它可分为三层，即在膜的靠内外两侧各有一条厚约2.5nm 的电子致密带，中间隔有一层厚约2.5nm 的透明带，总厚度约为7.5nm 。这种膜性结构在细胞膜和胞内细胞器上均可见到。 多种膜性结构的化学分析表明，膜的主要组成部分有脂质、蛋白质和糖类等，一般以脂质和蛋白质为主，糖类的含量很少。膜性结构的共同特点是，以液态脂质双分子层为基架，其中镶嵌着具有不同生理功能的蛋白质。蛋白质的功能主要是：让多种物质如离子和营养物质、代谢产物有选择地通过膜蛋
白质、如下面将要讨论的离子通道(ionic
channel )、离子泵(ionic pum p )等；另一方面，蛋白质分布在细胞膜表面，能辨认和接受细胞环境中特种化学性刺激或信号，称之为受体，通过受体和膜结构中其他酶类物质的作用，能将胞外的信息传递到胞内，引发细胞功能的相应改变。由此可见，细胞膜的脂质双分子层构成细胞的包被，而膜蛋白质则使细胞与周围环境进行物质、能量和信息的交换，藉以维持生命的延续，并协调周围细胞的相互联系。2 生物电信号的离子机制2.1 细胞膜的离子分布 人体和动物中的电信号是由若干种离子，如
K +、Na +、C1-和C a 2+所运载。这些离子运载着正、负电荷，从活体的一处流动到另一处。在可兴奋细胞上，离子的跨膜运动导致跨膜电位的变化，这些电位的变化就是原始的电信号，它们将生物信息从细胞的一部分转运到细胞的另一部分，从一个细胞转运到另一个细胞，从活体的一部分转运到另一部分。 生物系统中的离子分布是不均匀的，一部分的离子浓度与另一部分颇不一致。例如，多数动物细胞内,Na +、C1-和Ca 2+等离子，其胞内浓度低于胞外浓度，而K +则相反。这种离子分布的差异在生物系统中就引起浓度梯度的变化。根据热力学原理，离子将从高浓度区向低浓度区流动，称之为扩散。 由于游离的离子运载着电荷，因而它们的运动不仅要受浓度梯度的影响，而且也要受电场(电位梯度)的影响。在活体的大部分，生物分子的剩余电荷为零，换言之，在一定的容积内，正电荷数等于负电荷数，即空间电荷呈中性。但在单个细胞的膜内，这种中性的空间电荷属例外，因为多数细胞膜对某些离子可以通透，但对另外一些离子则不能通透，可见细胞膜起了电荷隔离作用。这种离子隔离导致在细胞膜上产生跨膜电场，带正电荷的离子将顺着电场方向流动，称之为
漂移。扩散与漂移均将影响通过膜上蛋白质孔道或离子通道的离子运动。
在实际情况下，所有活细胞自身力图维持它们的膜内外的浓度梯度，虽然它们的膜是可以通透离子的。例如，细胞膜上的N+a -K+泵，可以引起[N+a]O>[N+a]i和[K+]i> [K+]O。还有，在胞内存在不可通透的阴离子，如S O2-4和被充电的蛋白质。根据空间电荷呈中性的原理，胞内阴离子吸引着较多的K+入内，而排斥较多的C1-在外。2.2 细胞膜的静息电位和动作电位
(1)静息电位 前已介绍，由于细胞膜对不同的离子具有不同的通透性，加上某些离子自身转运机制以及细胞膜的包被隔离作用，导致膜内外的离子浓度存在差异。对于某一离子来说，在浓度和电位两种梯度的驱动下，产生扩散和漂移运动，当两种运动达到动态平衡时，通过膜上的离子通道电流等于零，此时膜电位称之为平衡电位E i，其值由南斯(Nernst)方程确定[3]。
事实上，构成静息电位，不是单一的离子。细胞内的有机阴离子，如蛋白质，不能通透到膜外。K+的有效直径甚小，其浓度梯度也大，易于顺着浓度梯度流向膜外。尽管[Na+]O>[Na+]i，但不及K+那样容易通透，进入膜内的Na+又将为Na+-K+泵所泵出，而且当有Na+被泵出时，同时有K+通透到胞内作为交换。C1-虽然也存在一定的浓度梯度，但当它向膜内透入时，将受到膜内阴离子的排斥。这样，在静息状态下，细胞膜的通透性主要体现在K+的外流。总的效果是：细胞膜的外侧聚集较多的阳离子(带正电)，膜的内侧则相反，有较多的阴离子(带负电)，这就形成了跨膜两侧的电位差，膜外为正，膜内为负。这就是细胞膜上的静息电位。例如，在考虑K+、Na+、C1-的情况下，静息电位的值V rest=-70mV[3]。
(2)动作电位 所有可兴奋的细胞，含神经细胞、肌肉细胞、内分泌细胞等，其膜上均含有电压门控型阳离子通道，它们均能响应外界刺激信号以产生动作电位。动作电位是由膜的去极化所产生，即膜电位较小的负值方向移动。
在电生理研究中，常用电冲击或电流作为刺激信号以引起膜电位的变化。当外加电流作跨膜流动时含有两种可能的成分，即离子通道电流和电容电流。现代电生理研究中，使用膜片钳技术中的电流钳以测量细胞膜的动作电位。
对神经细胞的研究结果表明，细胞膜的动作电位与Na+通道的开放有关。前面对Na+、K+的分析已知,Na+和K+在膜内外的浓度关系为:[Na+]O>[Na+]i和[K+]i> [K+]O。现以神经细胞为例，在外加脉冲电流的刺激下，膜上产生动作电位的过程如图2所示。图中纵坐标表示膜电位，单位为mV；横坐标表示时间，单位为ms。时间轴上对应于膜电位的变化划分为A、B、C、D四个阶段，这就是膜电位的时程图，现就各个阶段的电生理过程简述如下:
A段：此阶段对应于细胞处于静息状态，其膜电位约为-70mV，此时Na+和K+通道均处于关闭状态。
B段：在0点，一脉冲电流信号刺激细胞膜，形成足够强的去极化作用，从而使Na+通道开放，让少量的Na+流入细胞并降低其浓度梯度、正电荷的内流使膜进一步去极化，从而打开更多的Na+通道，在若干毫秒的时间内，形成自放大的过程，以及膜电位由约-70mV上移到Na+的平衡电位约+50mV，其中当V m>0时，称为超极化。此时Na+通道开放，但K+通道仍处于关闭状态。
C段：这一阶段出现复极化现象。Na+的净通量为零,Na+通道失活;K+通道开放形成快速下降的复极化过程。
D段:Na+通透率回复到通常的低水平，即Na+通道关闭;K+通透率升高，通道开放,
直到仍回复到A 段的静息状态
。
图2 细胞膜电位的时程图
由此可知，动作电位的产生来源于外来
刺激信号，先后激活Na +、K +通道，由膜的静息状态经去极化(含超极化)、复极化、下冲再回到静息状态。动作电位的幅度主要取决于Na +的平衡电位。 还须注意，静息电位和动作电位除与Na +、K +有关外，还与C a +、C 1-1有关。例如，在动作电位产生期间，考虑当K +、Na
+和C 1-的作用，动作电位的幅值为V m =+44m V [3]。2.3 可兴奋细胞膜的等效电路 细胞膜具有电路元件(如电阻器、电容器等)类似的特性，如图3(a )所示。因而可用图3(b )所示的等效电路来表征。其中,R m 为膜电阻，表示离子通道的电阻;C m 为膜电容，表示膜的脂质双分子层的介电特性;E r 为反向电位。由等效电路并根据节点电流定律，可得出如下的方程式
图3 细胞膜的等效电路
(a )细胞膜 (b )等效电路
I m =I c +I i =C m
d V m dt +V m -E r
R m
=C m
d V m
dt
含气量+G m (V m -E r )(1)
其中:V m 为膜电位;I m 为膜电流，是电容电流I c 与离子通道电流I i 之和(A/cm 2);R m 为膜的比电阻(Ω/cm 2);G m (1/R m )为膜的比电导(S/cm 2);C m 为膜的比电容(F/cm 2)；以及E r 为细胞的静息电位；但当某一离子形成I i 时，则E r 将被平衡电位E i (
对应于离子i )所代替。利用等效电路的概念，在电生理实验中，可以测量细胞的膜电流I m 和膜电位V m 的值。
3 膜片钳实验系统的组建3.1 膜片钳技术
这里要介绍的是无损伤、性能优良、测量模式多样的膜片钳技术。图4是膜片钳放大器的前置电路(探头电路)。电路由高增益集成运算放大器A 1和A 2组成。A 1与反馈电阻R f 组成电压并联负反馈电路,A 2组成单位增益差分电路。A 1的输入端通过玻璃微电极与细胞膜封接；电极尖端直径约为1μm ，因而
封接微区形成一微小的膜片。微电极经过细胞、浴池中的参考电极和放大电路构成回路。根据负反馈放大电路的原理,A 1的两输入端之间形成“虚短”的现象。当A 1的同相输入端外加一命令电压V c (方波)时，可使细胞膜钳位于V c ，但信号源电路并不影响被测细胞的活性状态，符合生物测量的要求。
图4 膜片钳放大器的探头电路
图5 膜片钳实验系统示意图 右侧为光学部件，主要包括：倒置显微镜(Z eiss
Axiovert 100)、单光发生器(TI LL P olychrome 11)等；右侧为电子学部件，主要包
括：膜片钳放大器(HEK A EPC -9)、计算机接口(数据采集)板(Instrutech ITC -16)、计算机(APP LE M AC650)、监视器(APP LE ,17”彩显)等。括号内为生产厂家及
型号示例。这是华中理工大学生物所膜片钳实验系统图。
在V c 的作用下，电极电流I p (即离子通道电流)流经电阻R f 产生电压V O1-V c =-I p R f ，经过单位增益差分放大(A 2)得
非诚勿扰18期V O =I p R f 。
(2)
式(2)表明，图4所示电路的I p -V O 关系遵守欧姆定律。膜片钳位与欧姆定律相结合构成膜片钳技术的独特优点，图4所示的电路，输入为电流，输出为电压，故称之为电流-电压(I -V )变换器。3.2 膜片钳实验系统的组建
根据电生理研究人员的实验要求，可以组建不同的实验系统。但是也有若干共同的基本部件。其中包括电子学部件、光学部件和光电接口部件。图5表示膜片钳实验系统的示意图。图中：左侧为光学部件，主要由倒置显微镜、单光发生器组成。倒置显微镜置于防震工作台上，并用铜丝网予以屏蔽接地。右侧为电子学部件，主要由膜片钳放大器、计算机接口板、计算机、控制单元组成；光电倍增管是光电接口部件。这个系统实际上
是膜片钳与显微荧光测量的光电联合检测系
统。它既可用来记录细胞膜离子通道电流
,
图6 用膜片钳技术作胞外记录 (a )细胞膜单
(离子)通道记录原理图：细胞置于浴池中，玻璃微
电极中置入Ag/AgCl 电极丝，参考电极置于浴池中，两个电极通过外接的膜片钳放大器形成回路，以测量通道电流。通常在电极内液和细胞外液中均含
C1-。这样，在外接导线(如铜)中为电子导电，而在
液体中为离子导电。(b )单通道电流波形图。
又可用来测量胞内钙离子浓度[Ca 2+]i 。 除图5所示的主要光学部件和电子学部件之外，还有其他若干辅助部件，例如，玻璃
微电极拉制仪和抛光仪，微电极定位的微操纵器，添加试剂或溶液的灌流设备等。3.3 膜片钳实验技术 这里要介绍的是利用膜片钳放大器记录离子通道电流。图6(a )表示细胞膜单离子通道电流记录的原理图，用玻璃微电极与细胞膜形成贴附式模式(其他三种模式见第二讲)。当玻璃微电极与细胞膜紧密封接时，可以无创伤地记录单(离子)通道电流波形(图6(b ))。由图可见，当封接良好，封接电
阻很高(G Ω)、封接电流
I seal 很小且较稳定时，通
道电流I chan 可以较准确
地测量，其值常在pA
(1012A)量级(图)6(b)的左部)。图6(b)的右部表示封接不良的情况，在波形上出现了较大幅度的噪声，称之为封接噪声，表明封接电阻不够高，且不稳定。封接噪声是膜片钳系统噪声来源之一；对于单通道记录来说，它是影响最大的一种噪声，实验过程中应耐心地反复试验。此外，尚有电极噪声和电子仪器噪声等。
4 小结
● 离子和离子通道是细胞兴奋的基础，也是产生生物电信号的基础。
● 细胞膜上的离子分布是非均匀的，大多数动物细胞的Na+、C1-和Ca2+，其胞内浓度低于胞外浓度，而K+则相反。这一方面是由于膜蛋白质的主动转运功能所致；另一方面则是由于跨膜的离子扩散与漂移运动达到平衡状态的结果。
● 跨膜两侧的离子由两种梯度所制约：浓度梯度和电位梯度(电场)，前者形成扩散运动，后者形成漂移运动；当二者达到动态平衡时，跨膜离子电流等于零。此时的平衡电位由Nernst方程确定。
● 细胞膜可用电路参数来表征，脂质双分子层的介电特性可用电容C来表示，而
离子通道则可用电导G来表示。
● 细胞膜的静息电位和动作电位与多种离子及其通透性有关，动作电位是在外界刺激信号的作用下，膜电位变化的时程表示。
● 膜片钳是借助高增益运放形成的“虚短”概念，使细胞膜钳位于外加命令电压，以保证被测细胞不受外界的影响。
冗余链路
● 膜片钳技术广泛用于细胞膜离子通道电流的测量、细胞分泌、药理学、病理生理学、神经科学、脑科学、细胞生物学与分子生物学的桥梁，以及植物细胞的生殖生理的研究等[2]。
参 考 文 献
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(上接第132页)
行)分别进行校正。一个投影完后再进行下一个投影的校正。SIRT中，得到一投影的校正序列后，不是直接进行校正，而是在得到每一投影的校正序列后，反投影重建，得到二维的校正图，再对重建物体的各像素点进行校正。
参 考 文 献
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P109421097
豫公网安备41160202000603
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