高 洁１，２，黄燕云１，２，张雨彤１，２，杜相欣１，２，张利娜１，２，郝 娜１，２，郭 霞１，２，李建国１，２，张 宇１
，２△
（１．山西医科大学细胞生理学教育部重点实验室，２．山西医科大学生理学系，太原０３０００１） 【摘要】 目的：介绍一种利用膜片钳技术标记脑片神经元形态的方法。方法：利用振动切片机切好实验目标部
位的脑片，用含有Ｎ
ｅｕｒｏｂｉｏｔｉｎＴＭ
Ｔｒａｃｅｒ的电极内液灌注玻璃微电极，并进行全细胞膜片钳记录；实验结束后将脑片先用４％多聚甲醛固定、漂洗，再用含有Ｓｔｒｅｐｔａｖｉｄｉｎ ＴｅｘａｓＲｅｄ和ＴｒｉｔｏｎＸ １００的ＰＢ染，２ｈ后即可用荧光显微镜观察着的神经元。结果：将细胞膜电压钳制在 ７０ｍＶ，阶跃刺激后神经元表现为逐渐增大的膜电流。电流钳模式记录时，阶跃刺激使神经元去极化，达到阈电位后爆发动作电位。荧光显微镜下可看到胞体和主要突起清晰完整的神经元形态。结论：本方法适用于在膜片钳实验后观察所记录的神经元的形态特征，操作方便，图像直观清晰。
【关键词】 全细胞膜片钳；脑片；神经元形态；荧光标记
【中图分类号】Ｒ３３８．８ 【文献标识码】Ａ 【文章编号】１０００ ６８３４（２０２１）０４ ４４５ ００４【ＤＯＩ】１０．１２０４７／ｊ．ｃｊａｐ．６０３５．２０２１．０３１
Ａｍｅｔｈｏｄｏｆｍａｒｋｉｎｇｎｅｕｒｏｎｓｏｎｂｒａｉｎｓｌｉｃｅｓｕｓｉｎｇｐａｔｃｈ
ｃｌａｍｐｔｅｃｈｎｉｑｕｅ
ＧＡＯＪｉｅ１，２，ＨＵＡＮＧＹａｎ ｙｕｎ１，２，ＺＨＡＮＧＹｕ ｔｏｎｇ１，２，ＤＵＸｉａｎｇ ｘｉｎ１，２，ＺＨＡＮＧＬｉ ｎａ１，２菲达协同
，
ＨＡＯＮａ１，２，ＧＵＯＸｉａ１，２，ＬＩＪｉａｎ ｇｕｏ１，２，ＺＨＡＮＧＹｕ
第欧根尼>激点文学１，２△
（１．ＫｅｙＬａｂｏｒａｔｏｒｙｏｆＣｅｌｌｕｌａｒＰｈｙｓｉｏｌｏｇｙ，ＭｉｎｉｓｔｒｙｏｆＥｄｕｃａｔｉｏｎ，ＳｈａｎｘｉＭｅｄｉｃａｌＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，２．ＴｈｅＤｅｐａｒｔｍｅｎｔｏｆＰｈｙｓｉｏｌｏｇｙ，
ＳｈａｎｘｉＭｅｄｉｃａｌＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｔａｉｙｕａｎ０３０００１，Ｃｈｉｎａ）
【ＡＢＳＴＲＡＣＴ】Ｏｂｊｅｃｔｉｖｅ：Ｔｏｉｎｔｒｏｄｕｃｅａｍｅｔｈｏｄｏｆｍａｒｋｉｎｇｎｅｕｒｏｎｓｕｓｉｎｇｐａｔｃｈｃｌａｍｐｔｅｃｈｎｉｑｕｅ．Ｍｅｔｈｏｄｓ：Ｔｈｅｂｒａｉｎｓｌｉｃｅｓｏｆｔｈｅ
ｔａｒｇｅｔａｒｅａｗａｓｃｕｔｗｉｔｈａｖｉｂｒａｔｉｎｇｍｉｃｒｏｔｏｍｅ．ＴｈｅｇｌａｓｓｍｉｃｒｏｅｌｅｃｔｒｏｄｅｗａｓｐｅｒｆｕｓｅｄｗｉｔｈｔｈｅｅｌｅｃｔｒｏｄｅｌｉｑｕｉｄｃｏｎｔａｉｎｉｎｇＮｅｕｒｏｂｉｏｔｉｎ
ＴＭ
Ｔｒａｃｅｒ，ａｎｄｔｈｅｗｈｏｌｅ ｃｅｌｌｐａｔｃｈ ｃｌａｍｐｒｅｃｏｒｄｉｎｇｗａｓｐｅｒｆｏｒｍｅｄ．Ａｆｔｅｒｒｅｃｏｒｄｉｎｇ，ｔｈｅｂｒａｉｎｓｌｉｃｅｓｗｅｒｅ
ｆｉｘｅｄａｎｄｒｉｎｓｅｄｗｉｔｈ４％ｐａｒａｆｏｒｍａｌｄｅｈｙｄｅ．ＡｆｔｅｒｓｔａｉｎｅｄｉｎｐｈｏｓｐｈａｔｅｂｕｆｆｅｒｗｉｔｈＳｔｒｅｐｔａｖｉｄｉｎ ＴｅｘａｓＲｅｄａｎｄＴｒｉｔｏｎＸ １００ｆｏｒａｔｌｅａｓｔ２ｈｏｕｒｓ，ｔｈｅｎｅｕｒｏｎｓｃａｎｂｅｏｂｓｅｒｖｅｄｕｎｄｅｒａｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅｍｉｃｒｏｓｃｏｐｅ．Ｒｅｓｕｌｔｓ：Ｔｈｅｃｅｌｌｍｅｍｂｒａｎｅｖｏｌｔａｇｅｗａｓｃｌａｍｐｅｄａｔ ７０ｍＶ，ａｎｄｔｈｅｎｅｕｒｏｎｓｈｏｗｅｄａｇｒａｄｕａｌｌｙｉｎｃｒｅａｓｉｎｇｍｅｍｂｒａｎｅｃｕｒｒｅｎｔａｆｔｅｒｓｔｅｐｓｔｉｍｕｌａｔｉｏｎ．Ｗｈｅｎｒｅｃｏｒｄｉｎｇｉｎｔｈｅｃｕｒｒｅｎｔｃｌａｍｐｍｏｄｅ，ｔｈｅｓｔｅｐｓｔｉｍｕｌｕｓｃａｕｓｅｄｔｈｅｎｅｕｒｏｎｔｏｄｅｐｏｌａｒｉｚｅｔｏｔｈｅｔｈｒｅｓｈｏｌｄｐｏｔｅｎｔｉａｌａｎｄｔｈｅｎｂｕｒｓｔｉｎｔｏａｃｔｉｏｎｐｏｔｅｎｔｉａｌｓ．Ｔｈｅｍｏｒｐｈｏｌｏｇｙｏｆｉｎｔａｃｔｎｅｕｒｏｎｓｗｉｔｈｃｌｅａｒｃｅｌｌｂｏｄｙａｎｄｐｒｏｔｒｕｓｉｏｎｓｏｆａｎｅｕｒｏｎｃｏｕｌｄｂｅｏｂｓｅｒｖｅｄｕｎｄｅｒａｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅｍｉｃｒｏｓｃｏｐｅ．Ｃｏｎｃｌｕｓｉｏｎ：Ｔｈｉｓｍｅｔｈｏｄｉｓｓｕｉｔａｂｌｅｆｏｒｏｂｓｅｒｖ ｉｎｇｔｈｅｍｏｒｐｈｏｌｏｇｉｃａｌｆｅａｔｕｒｅｓｏｆｔｈｅｒｅｃｏｒｄｅｄｎｅｕｒｏｎａｆｔｅｒｐａｔｃｈｃｌａｍｐｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔｓ，ｗｈｉｃｈｉｓｅａｓｙｔｏｏｐｅｒａｔｅ，ａｎｄｔｈｅｉｍａｇｅｉｓｉｎｔｕｉｔｉｖｅａｎｄｃｌｅａｒ．
【ＫＥＹＷＯＲＤＳ】 ｗｈｏｌｅ ｃｅｌｌｐａｔｃｈｃｌａｍｐ； ｂｒａｉｎｓｌｉｃｅｓ； ｎｅｕｒｏｎａｌｍｏｒｐｈｏｌｏｇｙ； ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅｔａｇｓ胡延照
【基金项目】国家自然科学基金项目（８１３７１２５４）；山西省
‘１３３１工程’重点学科建设计划经费（ＸＫ２０１７０８）；山西省自然科学基金（２０１８０１Ｄ１２１３１８）【收稿日期】２０２０ ０３ ０６【修回日期】２０２１ ０１ １８ △【通讯作者】Ｔｅｌ：（０３５１）４１３５５６０或３９８５１６３；Ｅ ｍａｉｌ：ｚｈｙｕｃｎｍ＠１６３．ｃｏｍ
在进行脑片膜片钳实验时，经常需要甄别实验中选取的是哪一类细胞。通常是根据目标区域中细胞的镜下形态、细胞的静息电位及一些电生理学特性来进行初步的鉴别和区分。本实验室采用了一种通过全细胞膜片钳技术对脑片上目标神经元实施荧光标记的方法。该方法在记录离子通道电流后经过
处理就可以更直观呈现观察神经元胞体和部分突起的形态，为实验提供形态学的证据。
实验中用到的两种染生物制剂分别为Ｎｅｕｒｏ
ｂｉｏｔｉｎ
ＴＭ
Ｔｒａｃｅｒ和Ｓｔｒｅｐｔａｖｉｄｉｎ ＴｅｘａｓＲｅｄ。神经生物素（ Ｎｅｕｒｏｂｉｏｔｉｎ）是生物素的一种氨基衍生物，可作为细胞尤其是神经元的胞内标记物，使神经结构及其连接呈现可视化。神经生物素溶解度高，被离子导入性好，无毒可在细胞内长时间维持，因此它被广泛应用于通过细胞内记录技术对细胞进行电生理学
表征后，从形态上鉴定神经元［１ ３］
。链霉亲和素
（
Ｓｔｒｅｐｔａｖｉｄｉｎ）是由链霉菌分泌的一种蛋白质，分子量为６５ｋＤ，是一种稍偏酸性（ｐＨ６．０）的蛋白质。
５
４４中国应用生理学杂志，２０２１，３７（４）拉线绝缘子
一个链霉亲和素分子可以结合４个生物素分子。链霉亲和素与生物素有很高的结合活性，因此被广泛用于检测生物素或生物素偶联的各种蛋白、核酸及其它分子。溶解的链霉亲和素可以在较宽的温度和
ｐＨ范围内保持稳定，且特异性高［４］。被ＴｅｘａｓＲｅｄ
标记的链霉亲和素可与Ｎｅｕｒｏｂｉｏｔｉｎ结合，发出红荧光。ＴｅｘａｓＲｅｄ标记的链霉亲和素的发射波长（Ｅｍ）为６０２ｎｍ，激发波长（Ｅｘ）为５８２ｎｍ。本文中以大鼠皮层和海马锥体神经元为样本介绍脑片膜片钳实验中标记所记录神经元形态的具体染方法，为进行电生理学检测的神经元提供形态学证据。
１ 材料与方法
１．１ 主要材料
取出生１０～２０ｄ健康雄性ＳＤ大鼠（购自山西医科大学动物实验中心）；
４％多聚甲醛；０．０１ｍｏｌ／Ｌ磷酸缓冲液（ＰＢ）；ＮｅｕｒｏｂｉｏｔｉｎＴＭＴｒａｃｅｒ产自美国
Ｖｅｃｔｏｒｌａｂｓ公司，Ｓｔｒｅｐｔａｖｉｄｉｎ ＴｅｘａｓＲｅｄ产自美国Ｉｎ ｖｉｔｒｏｇｅｎ公司；ＴｒｉｔｏｎＸ １００产自北京索莱宝科技有限公司，钠、ＮａＨＣＯ３、ＫＣｌ、ＮａＨ２ＰＯ４、ＮａＣｌ、ＣａＣｌ２、ＭｇＳＯ４、ＨＥＰＥＳ、Ｇｌｕｃｏｓｅ、ＥＧＴＡ、Ｋ Ｇｌｕｃｏｎａｔｅ、Ｎａ２ｐｈｏｓｐｈｏｃｒｅａｔｉｎｅ、Ｎａ２ＡＴＰ、Ｎａ３
ＧＴＰ和Ｍｇ ＡＴＰ均产自美国Ｓｉｇｍａ公司，带芯微电极玻璃管ＧＢＦ１５０ ８６ １０ＨＰ产自美国Ｓｕｔｔｅｒ公司。１．２ 脑片制备
溶液配制：切片液（ｍｍｏｌ／Ｌ）含ＮａＨＣＯ３２６，ＫＣｌ２．５，ＮａＨ２ＰＯ４１．２５，ＣａＣｌ２０．５，ＭｇＳＯ４７，ＨＥＰＥＳ５，Ｇｌｕｃｏｓｅ１０，Ｓｕｃｒｏｓｅ２１０，ｐＨ７．２～７．４，渗透压２９５～２０５ｍＯｓｍ／ｋｇ，４℃保存；孵育液（ｍｍｏｌ／Ｌ）含ＫＣｌ２．５，ＣａＣｌ２２，ＮａＨ２ＰＯ４１．２５，ＮａＣｌ１２４，ＮａＨＣＯ３２６，Ｇｌｕｃｏｓｅ１０，ｐＨ７．２～７．４，渗透压２９５～２０５ｍＯｓｍ／ｋｇ，现配现用；电极内液含Ｋ Ｇｌｕｃｏｎａｔｅ１２０，ＫＣｌ５，ＨＥＰＥＳ１０，ＥＧＴＡ５，ＣａＣｌ２０．５，ＭｇＳＯ４２，Ｎａ２ｐｈｏｓｐｈｏｃｒｅａｔｉｎｅ５，Ｎａ２ＡＴＰ５，Ｎａ３ＧＴＰ４，Ｍｇ ＡＴＰ４，ｐＨ７．２～７．４，渗透压２９５～２０５ｍＯｓｍ／ｋｇ，用１．５ｍｌ的ＥＰ管分装，每管１ｍｌ， ２０℃保存；含有神经生物素的电极内液为１ｍｌ的电极内液中加入５０μｇ
的ＮｅｕｒｏｂｉｏｔｉｎＴＭＴｒａｃｅｒ粉末（５％），然后用１．５ｍｌ的
ＥＰ管分装，每管２５μｌ， ２０℃保存；４％的多聚甲醛（ｐＨ７．２～７．４）；０．１ｍｏｌ／Ｌ磷酸缓冲液（ｐＨ７．２～７．４）。
制备离体脑片：健康雄性ＳＤ大鼠，用１％钠腹腔麻醉后快速被断头取脑，置于４℃氧饱和（９５％Ｏ２和５％ＣＯ２）的切片液中冷却十几秒后取出。用ＰｒｅｃｉｓｉｏｎａｒｙＩｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓＶＦ ７００振动切片机
进行脑片标本制备。沿冠状面修切掉不需要的部分，再用５０２胶水将其粘于振动切片机配套的组织托柄上，并用琼脂固定，然后迅速将其置于切片槽中并倒入４℃切片液，浸没脑组织块，调整好刀片和组织的距离后开始切片。切片机震动频率为７，前进速度为３，脑片厚度为２００μｍ。沿冠状面每切出一片脑片，就将其迅速转移到室温（２５℃）孵育液中。切片液和孵育液中都持续通混合气（９５％Ｏ２和５％ＣＯ２）。切好的脑片孵育１ｈ后即可观察记录。１．３ 神经元的染标记
膜片钳记录模式下染料灌注：将孵育好的脑片移至脑片膜片钳设备的记录槽中，并用尼龙盖网固定。将拉制好的玻璃电极尾端浸入含有神经生物素的电极内液中，利用虹吸作用使尖端充灌标记液后，尾端注入不含神经生物素的电极内液。将电极安装在电极夹持器上，然后利用微型操纵器使其缓慢下降，在快接近脑片时给少许正压。选择轮廓清晰，胞体较亮，折光性好的细胞，当电极接触到细胞表面时撤去正压，并施加适当负压，使电极尖端与细胞表面形成高阻封接（ＧΩ）。待封接稳定后再次给予负压使细胞破膜形成全细胞记录模式。撤去负压，将放大器设置到ｗｈｏｌｅ ｃｅｌｌ模式进行膜片钳电生理记录。若细胞的静息电位大于 ５０ｍＶ，则表明细胞状态良好，可继续记录。根据实验需求，使用事先编辑好的Ｐｒｏｔｏｃａｌ或采用Ｇａｐ ｆｒｅｅ模式进行记录。每个细胞至少记录
１０ｍｉｎ以上，使电极内液中的神经生物素充分进入细胞中。每片脑片上标记１～３个神经元。脑片标记完后置于４％多聚甲醛中常温下固定２ｈ以上（若脑片厚度超过２００μｍ，可酌情延长时间，也可４℃过夜）。
神经元染与观察：固定好的脑片用０．１ｍｏｌ／Ｌ的ＰＢ震荡漂洗３次，每次５ｍｉｎ。在ＰＢ中加入０．１％的ＴｒｉｔｏｎＸ １００（一种非离子型表面活性剂，溶解脂质，以增加染料细胞膜的通透性）和０．１％的液体染料（如５ｍｌ的ＰＢ中加入５μｌＴｒｉｔｏｎＸ １００和５μｌＳｔｒｅｐｔａｖｉｄｉｎ ＴｅｘａｓＲｅｄ）避光震荡混匀２ｈ以上，再用ＰＢ漂洗２次后即可用荧光显微镜观察。
２ 结果
２．１ 神经元的膜片钳记录
用全细胞脑片膜片钳法，对大鼠前扣带皮层及海马部位的锥体神经元采用电压钳和电流钳模式，记录神经元在不同电压刺激下膜电流的变化的反应和不同电流刺激下膜电压的变化反应，如图１所示。电压钳模式记录时，钳制电压为 ７０ｍＶ，通过记录电
６４４ＣｈｉｎＪＡｐｐｌＰｈｙｓｉｏｌ，２０２１，３７（４）
极给一系列阶跃刺激（从 ５０～＋９０ｍＶ，阶跃１０ｍＶ，时程２００ｍｓ）。锥体神经元表现为逐渐增大的
膜电流。电流钳模式记录时，阶跃刺激（从 ３０～＋６０ｐＡ，增幅为１０ｐＡ，时程２００ｍｓ）使神经元去极化，
达到阈电位后爆发动作电位。
Ｆｉｇ．１ Ｗｈｏｌｅ ｃｅｌｌｐａｔｃｈｃｌａｍｐｒｅｃｏｒｄｉｎｇｒｅｓｕｌｔｓ．Ｔｈｅａｂｏｖｅ
ｓｈｏｗｅｄｔｈａｔｔｈｅｒｅｃｏｒｄｅｄｍｅｍｂｒａｎｅｐｏｔｅｎｔｉａｌｉｎｔｈｅａｎｔｅｒｉ ｏｒｃｉｎｇｕｌａｔｅｃｏｒｔｉｃａｌｎｅｕｒｏｎ（Ａ）ａｎｄｔｈｅｈｉｐｐｏｃａｍｐａｌｎｅｕ ｒｏｎ（Ｃ），ａｎｄｔｈｅｒｅｃｏｒｄｅｄｃｕｒｒｅｎｔｓｉｎｔｈｅａｎｔｅｒｉｏｒｃｉｎｇｕ ｌａｔｅｃｏｒｔｉｃａｌｎｅｕｒｏｎ（Ｂ）ａｎｄｔｈｅｈｉｐｐｏｃａｍｐａｌｎｅｕｒｏｎ（Ｄ），ｎ＝５
２．２ 神经元的染
经过上述全细胞膜片钳记录及染后，所选细
胞的形态如图２。锥体神经元的胞体直径约２０～４０μ
ｍ，图中可看到清晰的胞体和周围的突起，表明神经生物素ＮｅｕｒｏｂｉｏｔｉｎＴＭ
Ｔｒａｃｅｒ及其亲合物Ｓｔｒｅｐｔａｖｉ ｄｉｎ ＴｅｘａｓＲｅｄ
可用作标记神经元。Ｆｉｇ．２ Ｔｈｅｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔｐｈｏｔｏｇｒａｐｈｓｏｆｐｙｒａｍｉｄａｌｎｅｕｒｏｎｓｌａ
ｂｅｌｅｄｗｉｔｈｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒｆｌｕｉｄｃｏｎｔａｉｎｉｎｇＮｅｕｒｏｂｉｏｔｉｎ
ＴＭ
Ｔｒａｃｅｒｉｎａ１５ ｄａｙ ｏｌｄｒａｔ．Ｎｅｕｒｏｎｓｗｅｒｅｓｔａｉｎｅｄｗｉｔｈ
ｔｈｅｐｉｐｅｔｔｅｓｏｌｕｔｉｏｎｆｏｒａｐｅｒｉｏｄｏｆ２０ｍｉｎ（ｎ＝５）；Ｔｈｅｌｅｆｔｉｓｔｈｅａｎｔｅｒｉｏｒｃｉｎｇｕｌａｔｅｃｏｒｔｉｃａｌｎｅｕｒｏｎ，ｔｈｅｒｉｇｈｔｉｓｔｈｅｈｉｐｐ ｏｃａｍｐａｌｎｅｕｒｏｎ
３ 讨论
标记单个神经元的理想示踪剂必须满足多个要求，例如快速扩散，组织学处理过程中的稳定性等。
五网ＮｅｕｒｏｂｉｏｔｉｎＴＭ
是一种有效的神经解剖学示踪剂，可用于体内顺行、逆行和跨神经元描记，以及体外标记
神经元［５ ７］
。但也有研究表明，使用充满神经生物素
的电极，尤其是膜片钳电极，对中枢神经系统神经元的电生理特征有所影响，会给所获得的电生理数据的解释带来问题，如在使用膜片钳技术记录期间，示踪剂导致动作电位时程显著延长，且与浓度有关，其影响随记录时间的增加而增大，但不明显改变静息
膜电位等其他膜特性［８ １０］
。针对这一问题，本实验选择电极尖端充灌含有Ｎ
ｅｕｒｏｂｉｏｔｉｎＴＭ
的细胞内液，电极尾部注入普通电极内液，尽量减少生物素染料的使用量以减少对细胞电学特征的影响。另外，有实验室使用这种标记方法标记神经元时，为了避免移出电极时损伤细胞膜，采用减小玻璃微电极尖端直径的办法，但是高电阻尖端非常细小，易碎且容易
堵塞，因此不易获得并保持稳定的细胞内记录［
１１］
。经过多次实验发现，当电极尖端阻抗为５～７ＭΩ时，实验中既不影响细胞内记录，实验结束后缓慢将电极从细胞上移除，也不易破坏细胞膜结构的完整
性，有利于呈现完好的胞体和突起形态。
另外，实验时还需要注意以下几点：（１）配制液体的时候，一定要注意调节好液体的渗透压和ｐＨ值，液体的理化性质对脑片活性很关键；（２）切脑片的速度要快，从断头开始到脑片切好，整个过程不超过１
５ｍｉｎ，且时间越短脑片活性越好，染出来的细胞形态越接近真实状态，突起也会越明显；（３）细胞破膜后，可适当给予电刺激，有助于神经生物素在胞内扩散；（４）细胞记录完成以后，缓慢撤出电极，避免速度过快、幅度过大会损伤细胞膜，导致染料外漏甚至细胞死亡；（５）由于神经生物素对动作电位有影响，因此记录动作电位的数据仅供参考，不适合收入正式结果中；（６）普通荧光显微镜可以清晰观察细胞形态，但如果用激光共聚焦显微镜观察效果更好。
以上是本研究室在脑片上记录通道电流时标记目标神经元形态的方法及操作体会。通过该方法实
现了将膜片钳技术与直观的神经元形态标记相结合，有利于甄别和区分中枢神经系统中不同类型神经元的功能活动，实用性强，易于在膜片钳实验中应用。【参考文献】
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５６８．
（上接第４２２页）
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