摘要 本文主要从基本原理、分类，其技术原理，主要应用，发展前景和存在问题5个方面对DNA芯片的相关知识进行介绍，以了解DNA芯片的基本知识。
关键词 DNA芯片 基本原理 技术 发展前景
从人类基因组计划启动至今, 已完成了人类基因组全序列的测定, 并且已基本构建了人类基因组序列框架图。目前人们正在由研究基因的结构及染体定位的结构基因组学, 向研究基因表达调控及其在生物体中作用的功能基因组学转变。长期以来, 人们只能有限地研究一个基因或mRNA, 对于较大基因组和巨大的基因组序列数据库则需要新的有效的手段来处理, 常用的凝胶电泳无法达到这个要求, DNA芯片就这样应运而生。DNA芯片技术是多种学科、多种技术融合而成的, 在基因组研究、基因序列分析、发现新基因、基因表达研究、基因诊断等领域有较大的应用价值。
1 DNA芯片的基本原理
1991年底, 美国加州旧金山Affymatrix公司结合照相平板印刷、计算机、半导体、激光共聚焦扫描、寡核苷酸DNA合成、荧光标记探针杂交及其它分子生物学技术创造了世界上第一块DNA 芯片。 DNA芯片利用核酸杂交原理来检测未知分子, 将寡核苷酸或寡核苷酸片段按照一定的顺序排列在固相支持物上组成密集的分子阵列, 再用标记的目的材料DNA 或cDNA 进行杂交, 通过检测标记信号的分布谱型得到分子杂交情况, 并经计算机分析处理, 得到大量的序列或表达信息。DNA芯片所用的固相支持物有硅片、尼龙膜、载玻片等, 通常把以硅片为支持物的方法称为芯片。以其他材料为支持物的方法称微阵列。
2 DNA芯片的分类
DNA芯片产生的基础是分子生物学、微电子技术、高分子化学合成技术、激光技术和计算机科学的发展及其有机结合。根据DNA芯片制作过程中主要技术的区别，可以将DNA芯片分为以下四类：
2.1 光引导原位合成技术生产寡聚核苷酸微矩阵
Affymetrix公司采用了照相平版印刷技术结合光引导原位寡聚核苷酸合成技术制作DNA芯片，生产过程同电子芯片的生产过程十分相似。采用这种技术生产的DNA芯片可以达到1×106/cm2雾都孤儿论文的微探针排列密度，能够在一片1厘米多见方的片基上排列几百万个寡聚核苷酸探针。
原位合成法主要为光引导聚合技术，它不仅可用于寡聚核苷酸的合成，也可用于合成寡肽分子。光引导聚合技术是照相平版印刷技术与传统的核酸、多肽固相合成技术相结合的产物。固相合成技术是当前多肽、核酸人工合成中普遍使用的方法，技术成熟且已实现自动化。二者的结合为合成高密度核酸探针及短肽列阵提供了一条快捷的途径。
2.2 微电子芯片
Nanogen开发了多位点电控阵列并含独立可寻址检测区域的微电子DNA芯片，其基础全部为硅、锗与基础的半导体材料，在其上构建25~400个微铂电极位点，各位点可有计算机独立或组合控制。无论在芯片制造或成品芯片检测，均可通过相似微电极的电场变化来使核
酸结合，引入“电子严谨度”参数使芯片检测通过靶、探针序列特征和使用者要求来控制杂交过程中的严格性。这种微电子芯片具有以下优点：
（1）刘功臣电场运转过程中能够选择性的转运带电荷的DNA分子，通过每个微电极位点的电场正负、强弱变化，能准确有效地随意调控芯片表面的核酸，既可将核酸结合在微电极位点上，也可以使核酸转运起来。玩具兵大战3
（2）通过电场变化能加快DNA杂交速率，通过导入正电场后，可以大大加快待测核酸同已知探针的结合速率，减少了核酸反应时间，同普通的“被动”杂交反应的几小时相比，这种主动杂交反应仅仅几秒钟就可完成。另外电场变化又可以有效地去除未结合的游离分子，减少未结合荧光信号的干扰。
（3）通过电子严谨度可有效地控制杂交过程中的错配度，杂交错配的程度，对不同的要求上要给以不同的电场就可以符合不同的电子严谨度，这对核酸杂交严格度可以非常灵活的控制，可以非常准确的进行SNP检测。
2.3 微量点样技术
目前大部分生产DNA芯片的公司都采用这种方法，采用了先进更加微量的点样技术，可以点更加微量的探针。这种方法生产的芯片上探针不受探针分子大小种类的限制，能够灵活机动的根据使用者的要求制作出符合目的的芯片。
文姜 对于微量点样技术生产的DNA芯片来说从一起组成上可以分为点样仪器、杂交装置、检测仪器和分析仪器。点样器一般采用空心或实心点样针，点样方式有非接触喷点和接触点样两种方式。目前有两种非接触喷点技术用于DNA点样，一种是用压电晶体将液体从孔子喷出的压电技术，喷点大小一般为50-500pL，另一种为注射器螺丝管技术，这种技术是通过高分辨率注射器泵和微螺丝管阀门有机结合起来精确控制滴液的。tuodu
检测仪器也是一个重要的限制条件，如果检测仪器的分辨率不高，那么即使点样仪器制造出密度很高的芯片也没有用，对高密度的芯片通常使用激光共聚焦显微镜和高性能的冷却CCD，二者各有利弊，须根据要求综合测量。
显和分析测定方法主要为荧光法，激光共聚焦显微扫描技术和高性能的冷却CCD，以便于对高密度的探针阵列每个位点的荧光强度进行定量分析。因为探针与样品完全配对时所产生的荧光信号强度是具有单个或两个错配碱基探针的5—35倍，所以对荧光信号强度
进行精确测定是实现检测特异性的基础。
分析仪器从硬件上来说只是一部高性能的计算机，但其中最重要的分析软件。如果只是进行简单的检测和科学实验，待测样品所要分析的基因很少很简单，采用直观的观察就可以得出结论。但对于大量的基因分析或是临床检验人员就需要有全面智能化的分析软件辅助。
2.4 其他技术
主要是美国的Orchidbio公司，NIH公司，Caliper公司等。Orchidbio研制了一种毛细管微流泵芯片在边长2英寸的芯片上集成了144个微室，分别由流入孔、反应室、循环管和废液流出孔组成，这种芯片可以用于基因诊断分析以及合成化学。
3. DNA芯片的技术原理
3.1 DNA 芯片的制备
(1) 支持物的处理 DNA 合成芯片常采用硅片和普通玻璃片等刚性支持物。在合成寡核苷
酸前, 必须先使支持物表面衍生出羟基或氨基等活性基团, 使之与光敏材料的光敏保护基团形成共价交联而被保护起来。显微打印的DNA 微集阵列常选用聚丙烯膜和尼龙膜等薄膜型支持物, 该支持物上通常要包被氨基硅烷或多聚赖氨酸等,使其带上正电荷以吸附带负电的DNA 探针。
（2) 探针的制备 制备探针常用的方法主要有以下几种。
①显微光蚀刻技术 显微光蚀刻技术是寡核苷酸原位合成中的一种, 由美国Affymetrix公司开发, 它所采用的技术原理是在合成碱基单体的5'羟基末端连上一个光敏保护基。合成时,选择合适的光栏( light mask) 保护不需聚合的部位, 然后利用紫外光或可见光等照射使羟基端脱保护, 使活性基团游离出来, 再将一个5'端保护的核苷酸单体( 如dAMP) 连接上去, 更换光栏, 在支持物其余部位分别加上dGMP、dCMP、dTMP,完成第一循环, 这个过程反复进行直至合成完毕。该方法的优点是合成速度快, 能以更少的合成步骤生产出高密度的阵列, 在合成循环中探针数目呈指数增长。例如, 一个完整的八核苷酸只需4*8= 32 步, 8 h内可合成48( 65 536) 个探针。该方法的缺点是合成反应率不高, 不到0.195; 探针长度一般只有2~ 8 mer; 杂交信号比较模糊, 信噪比降低。
② 原位喷印合成法 芯片原位喷印合成原理与喷墨打印类似, 不过芯片喷印头和墨盒有多个,墨盒中装的是4 种碱基等液体而不是碳粉。喷印头可在整个芯片上移动, 并根据芯片上不同位点探针的序列需要将特定的碱基喷印在芯片特定位置, 然后冲洗、去保护, 进行寡核苷酸合成的下一循环。合成的探针可达40~ 50 mer, 每步产率可达0. 99。
③ 点样法 点样法是将合成好的探针、cDNA或基因组DNA通过特定的高速点样机器人直接点在芯片上。采用的机器人有一套计算机控制三维移动装置、多个打印/ 喷印针的打印/ 喷印头; 一个减震底座, 上面可放内盛探针的多孔板和多个芯片; 温度和湿度控制装置、针洗涤装置。
④电定位法 美国Nanogen 公司和法国CIS Biointernat ional 实验室采用此法。这种芯片为带有阳电荷的硅芯片, 芯片经过氧化, 制成1 mm*1 mm 的阵列, 每个阵列含多个微电极, 在每个电极上通过氧化硅沉积和蚀刻制备出样品池, 将连接链亲和素的琼脂糖覆盖在电极上, 在电场作用下生物素标记的探针即可结合在特定电极上。
3. 2 DNA 芯片的操作
斗形纹
DNA 芯片操作的基本过程为将分离纯化的生物样品DNA 或mRNA 先进行扩增、标记, 然后与芯片上探针阵列杂交, 通过对杂交信号的检测与分析, 即可获得待测样品的遗传信息。
( 1) 样品的制备 包括扩增和标记两个步骤。
①样品的扩增 目前, 由于DNA 芯片灵敏度所限, 待测的生物样品( DNA 或mRNA) 在标记和分析前要进行适当程度的扩增, 而且要求对样品中靶序列进行高效而特异的扩增。许多公司正设法解决这一问题[ 8] , 如Mosaic Technologies 公司引入固相PCR 方法, 引物特异性强, 无交叉污染并省去了液相处理的繁锁; Lynx Therapeut ics公司引入的大规模并行固相克隆法, 可在一个样品中同时对数以万计的DNA 片断进行克隆, 且无需单独处理和分离每个克隆。
②样品的标记 样品的标记除可用生物素、放射性同位素等标记外, 目前采用最普遍的是荧光标记法, 而且荧光素种类繁多, 可以满足不同来源样品的平行分析。常用荧光素Cy- 3、Cy- 4或生物素标记dNT P, 后者可用链霉亲和素偶联的荧光素或藻红蛋白等引导进一步检测。
豫公网安备41160202000603
站长QQ:729038198
关于我们
投诉建议