(19)中华人民共和国国家知识产权局
(12)发明专利申请
(10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请号 201780001722.0
(22)申请日 2017.01.09
(85)PCT国际申请进入国家阶段日
2017.12.01
(86)PCT国际申请的申请数据
PCT/CN2017/070604 2017.01.09
(71)申请人 深圳市邦泰绿生物合成研究院
地址 518102 广东省深圳市宝安区西乡街
道桃花源科技创新园A栋孵化楼501-
506、509-520室
(72)发明人 傅荣昭 刘立辉 曹磊 刘滔滔
彭亭
(51)Int.Cl.
C12P 33/02(2006.01)
C12N 9/04(2006.01)
(54)发明名称
(57)摘要
本发明涉及一种利用生物酶催化技术制备
熊去氧胆酸的方法及其制备用7β-类固醇脱氢
酶。该方法以3α-羟基-7氧代-5β-胆烷酸为底
物，在NADP、葡萄糖、葡萄糖脱氢酶以及缓冲溶液
存在的条件下，用7β-类固醇脱氢酶催化3α-羟
基-7氧代-5β-胆烷酸制备熊去氧胆酸，其中7
β-类固醇脱氢酶来源于扭链瘤胃球菌
Ruminococcus torques ATCC 27756。该方法操
作简单、反应条件温和易控、反应时间短、对底物
的转化率高达99.7%以上，所获得的产品的含量
在98.
5%以上。权利要求书1页 说明书6页序列表5页CN 107995929 A 2018.05.04
C N 107995929
A
1.一种熊去氧胆酸的制备方法，其特征在于：以3α-羟基-7氧代-5β-胆烷酸为底物，在NADP、葡萄糖、葡萄糖脱氢酶以及缓冲溶液存在的条件下，用7β-类固醇脱氢酶催化3α-羟基-7氧代-5β-胆烷酸制备熊去氧胆酸，所述7β-类固醇脱氢酶来源于扭链瘤胃球菌Ruminococcus torques ATCC 27756，所述葡萄糖脱氢酶来源于巨大芽孢杆菌Bacillus megaterium，其基因序列如SEQ ID NO：3所示，在整个催化反应体系中，所述底物的浓度为50～100mg/mL，所述NADP的浓度为0.01～0.25mg/mL，所述葡萄糖的浓度为30～50mg/mL。
2.根据权利要求1所述的熊去氧胆酸的制备方法，其特征在于：控制所述催化过程在温度为25～35℃，pH值为7.5～8.5的条件下进行。 3.根据权利要求1所述的熊去氧胆酸的制备方法，其特征在于：所述缓冲溶液为50～100mM磷酸钾缓冲液。
4.根据权利要求1所述的熊去氧胆酸的制备方法，其特征在于，所述制备方法还包括如下提纯步骤：待所述催化过程反应结束后，调节pH值为10.5～12.5，除去不溶物，再调节pH 值为1.0～2.0，水浴50-60℃，搅拌20～30min，待冷却后过滤、经水洗三次后真空干燥即得熊去氧胆酸的成品。
5.根据权利要求1至4任一项所述的熊去氧胆酸的制备方法，其特征在于所述7β-类固醇脱氢酶为如下(a)或(b)的蛋白质：
(a)其氨基酸序列如SEQ ID NO：2所示的蛋白质，
(b)在(a)限定的氨基酸序列中经过取代、缺失或添加一个或几个氨基酸并且在NADP存在下以3α-羟基-7氧代-5β-胆烷酸为底物具有比氨基酸序列如SEQ ID NO：2所示的亲本高的7β-类固醇脱氢酶催化活性的由(a)衍生的蛋白质。
6.根据权利要求5所述的熊去氧胆酸的制备方法，其特征在于所述7β-类固醇脱氢酶与如SEQ ID NO：2
所示的氨基酸序列相比在选自至少一个下述位点处具有至少一个突变：第66位、第90位、第91位、第97位、第150位、第153位、第189位、第191位、以及第200位。
7.根据权利要求6所述的熊去氧胆酸的制备方法，其特征在于所述7β-类固醇脱氢酶具有至少一个下述突变：D66N、Y90W、V91A、F97W、S150K、N153D、T189A、T191A以及G200K。
8.一种7β-类固醇脱氢酶，其特征在于：所述7β-类固醇脱氢酶来源于扭链瘤胃球菌Ruminococcus torques ATCC 27756，用于催化3α-羟基-7氧代-5β-胆烷酸制备熊去氧胆酸，所述7β-类固醇脱氢酶为如下(a)或(b)的蛋白质：
(a)其氨基酸序列如SEQ ID NO：2所示的蛋白质，
(b)在(a)限定的氨基酸序列中经过取代、缺失或添加一个或几个氨基酸并且在NADP存在下以3α-羟基-7氧代-5β-胆烷酸为底物具有比氨基酸序列如SEQ ID NO：2所示的亲本高的7β-类固醇脱氢酶催化活性的由(a)衍生的蛋白质。
9.根据权利要求8所述的7β-类固醇脱氢酶，其特征在于所述7β-类固醇脱氢酶与如SEQ ID NO：2所示的氨基酸序列相比在选自至少一个下述位点处具有至少一个突变：第66位、第90位、第91位、第97位、第150位、第153位、第189位、第191位、以及第200位。
10.根据权利要求9所述的7β-类固醇脱氢酶，其特征在于所述7β-类固醇脱氢酶具有至少一个下述突变：D66N、Y90W、V91A、F97W、S150K、N153D、T189A、T191A以及G200K。
权 利 要 求 书1/1页CN 107995929 A
一种熊去氧胆酸的制备方法及其制备用酶1
技术领域
[0001]本发明涉及分子生物学与生物技术领域，特别涉及一种利用生物酶催化技术制备熊去氧胆酸的方法及其制备用7β-类固醇脱氢酶。
背景技术
[0002]熊去氧胆酸是名贵中药熊胆的主要有效成分，具有增加胆汁酸分泌、并使胆汁成分改变、有利于胆结石中的胆固醇逐渐溶解、降低胆汁中胆固醇及胆固醇脂等功效，主要用于胆石疾病。众所周知，熊胆是一种非常稀缺的资源，原因在于其获取的传统途径主要是依赖于人工养殖活熊取胆的方法。目前，这种周期长、收率低且不人道的传统途径逐渐被人工合成方法所取代。
[0003]起初，熊去氧胆酸的人工合成方法多为化学法，并且被广泛应用于工业生产中。但是化学法存在
操作条件苛刻、选择性低、污染环境、使用大量有机溶剂、存在有机溶剂残留、有毒有害等缺点。为了解决化学法存在的诸多缺点，人们另辟蹊径，寻更好的生产途径。中国发明专利申请CN105368828A公开了一种采用全细胞催化制备3α-羟基-7氧代-5β-胆烷酸熊去氧胆酸的方法，但是此种方法需进行细胞发酵培养，存在反应时间长、操作繁琐、产物复杂等缺点。
发明内容
[0004]本发明的目的在于提供一种熊去氧胆酸的新的制备方法，以解决上述背景技术中提到的现有制备方法所存在的有机溶剂残留、条件苛刻、反应时间长、操作繁琐、污染环境等缺点，本发明同时提供了该新制备方法适用的生物酶。
[0005]为实现上述目的，发明人经过长期大量的实验摸索，在经历上百次的失败尝试之后，终于筛选出适用于细胞外生物催化制备熊去氧胆酸的生物酶，并在此序列基础上进行优化，获得了活性提高和去除底物抑制的突变体酶，从而开发出一种新的制备熊去氧胆酸的方法，其特征在于：以3α-羟基-7氧代-5β-胆烷酸为底物，在NADP、葡萄糖、葡萄糖脱氢酶以及缓冲溶液存在的条件下，用7β-类固醇脱氢酶催化3α-羟基-7氧代-5β-胆烷酸制备熊去氧胆酸，所述7β-类固醇脱氢酶来源于扭链瘤胃球菌Ruminococcus torques ATCC 27756，所述葡萄糖脱氢酶来源于巨大芽孢杆菌Bacillus megaterium，其基因序列如SEQ ID NO：3所示，在整个催化反应体系中，所述底物的浓度为50～100mg/mL，所述NADP的浓度为0.01～0.25mg/mL，所述葡萄糖的浓度为30～50mg/mL。
[0006]上述方法中所使用的两种酶的具体存在形式包括液态酶液、固态以及各种固定化酶，可以是未经纯化的粗酶形式，也可以是经部分纯化或完全纯化的形式。
[0007]优选地，控制所述催化过程在温度为25～35℃，pH值为7.5～8.5的条件下进行。[0008]优选地，所述缓冲溶液为50～100mM磷酸钾缓冲液。
[0009]优选地，上述制备方法还包括如下提纯步骤：待所述催化过程反应结束后，调节pH 值为10.5～12.5，除去不溶物，再调节pH值为1.0～2.0，水浴50-60℃，搅拌20～30min，待冷
却后过滤、经水洗三次后真空干燥即得熊去氧胆酸的成品。
[0010]更优选地，上述制备方法还包括如下精制步骤：将获得的熊去氧胆酸的成品用10-20倍无水乙醇50-60℃水浴条件下搅拌回流0.5-1h，热过滤，取滤液进行真空减压浓缩至1/ 4-1/5体积，再加入5-10倍纯水搅拌1h进行结晶，过滤，将滤饼真空干燥，即得熊去氧胆酸的精制品。
[0011]优选地，上述制备方法中所使用的7β-类固醇脱氢酶为如下(a)或(b)的蛋白质：[0012](a)其氨基酸序列如SEQ ID NO：2所示的蛋白质，
[0013](b)在(a)限定的氨基酸序列中经过取代、缺失或添加一个或几个氨基酸并且在NADP存在下以3α-羟基-7氧代-5β-胆烷酸为底物具有比氨基酸序列如SEQ ID NO：2所示的亲本高的7β-类固醇脱氢酶催化
活性的由(a)衍生的蛋白质。
[0014]更优选地，所述7β-类固醇脱氢酶与如SEQ ID NO：2所示的氨基酸序列相比在选自至少一个下述位点处具有至少一个突变：第66位、第90位、第91位、第97位、第150位、第153位、第189位、第191位、以及第200位。
[0015]更优选地，所述7β-类固醇脱氢酶具有至少一个下述突变：D66N、Y90W、V91A、F97W、S150K、N153D、T189A、T191A以及G200K。
[0016]本发明还提供了一种7β-类固醇脱氢酶，其特征在于：所述7β-类固醇脱氢酶来源于扭链瘤胃球菌Ruminococcus torques ATCC 27756，用于催化3α-羟基-7氧代-5β-胆烷酸制备熊去氧胆酸，所述7β-类固醇脱氢酶为如下(a)或(b)的蛋白质：
[0017](a)其氨基酸序列如SEQ ID NO：2所示的蛋白质，
[0018](b)在(a)限定的氨基酸序列中经过取代、缺失或添加一个或几个氨基酸并且在NADP存在下以3α-羟基-7氧代-5β-胆烷酸为底物具有比氨基酸序列如SEQ ID NO：2所示的亲本高的7β-类固醇脱氢酶催化活性的由(a)衍生的蛋白质。
[0019]优选地，所述7β-类固醇脱氢酶与如SEQ ID NO：2所示的氨基酸序列相比在选自至少一个下述位
点处具有至少一个突变：第66位、第90位、第91位、第97位、第150位、第153位、第189位、第191位、以及第200位。
[0020]优选地，所述7β-类固醇脱氢酶具有至少一个下述突变：D66N、Y90W、V91A、F97W、S150K、N153D、T189A、T191A以及G200K。
[0021]有益效果：
[0022]1、与现有的熊去氧胆酸的制备方法相比，本发明提供的方法具有操作简单、反应条件温和易控、反应时间短、不使用有机溶剂、无毒无污染且成本低廉的优点，经实践证明，本发明提供的方法的反应时长仅需6～12小时，其对底物的转化率高达99.7％以上，所获得的产品的含量在98.5％以上。
[0023]2、本发明筛选出了适用于细胞外生物催化制备熊去氧胆酸的7β-类固醇脱氢酶基因，并在此序列基础上进行优化，获得了活性提高和去除底物抑制的突变体酶，这些突变体酶表现出高的选择性使得该方法不会形成副产物，这些突变体酶的高催化活性和高专一性使得熊去氧胆酸酶法大规模生产的成本更低，具有较高的工业应用价值。
具体实施方式
[0024]下面结合具体实施例对本发明做进一步的详细说明，以下实施例是对本发明的解
释，本发明并不局限于以下实施例，实施例中未注明具体条件者，按常规条件或制造商建议的条件进行。
[0025]本发明提供的熊去氧胆酸的制备方法的具体实施过程如下：
[0026]将3α-羟基-7氧代-5β-胆烷酸悬浮于50～100mM磷酸钾缓冲液(pH8.0)中，用10M的NaOH调节pH到8.0，再加入终浓度为30～50mg/mL的葡萄糖并用10M的NaOH调节pH到7.8～8.0，加入7β-类固醇脱氢酶和葡萄糖脱氢酶，最后加入终浓度为0.01～0.25mg/mL的NADP，底物终浓度为50～100mg/mL，反应在温度25～35℃、200～400rpm和pH7.5～8.5进行，反应时间为6～12h。每隔一定时间取反应液用流动相稀释50～100倍，微孔过滤后进样进行液相分析。液相检测使用Phenomenx Gemini 5μmNX-C18 110A 250×4.6mm为分析柱，流动相为乙腈：缓冲溶液(取磷酸二氢钠0.78g，溶解1L水中，用磷酸调pH值为3，即可)：甲醇＝30:37: 40，用0.45um滤膜过滤后备用。柱温为40℃，示差检测器(RID)，流速为0.8mL/min。待催化过程反应结束后，在快速搅拌的情况下加入5～10M的NaOH调整反应液的pH值为10.5～12.5，过滤取滤液，滤液滴加盐酸至pH值为1.0～2.0，水浴50-60℃，搅拌20～30min，待冷却后过滤、经水洗三次后真空干燥即得熊去氧胆酸的成品。再将成品用10-20倍无水乙醇50-60℃水浴条件下搅拌回流0.5-1h，热过滤，取滤液进行真空减压浓缩至1/4-1/5体积，再加入5-10倍纯水搅拌1h进行结晶，过滤，将滤饼真空干燥过夜，即得熊去氧胆酸的精制品。[0027]上述方法中所使用的两种酶的具体存在形式包括液态酶、固态酶以及各种固定化酶，可以是未经纯化的粗酶形式，也可以是经部分纯化或
完全纯化的形式。
[0028]实施例1
[0029]含有亲本基因的共表达重组质粒pET22b-BHSDH3-GDH的制备
[0030]将来源于扭链瘤胃球菌(Ruminococcus torques ATCC 27756)的7β-类固醇脱氢酶基因BHSDH3和来源于巨大芽孢杆菌(Bacillus megaterium)的葡萄糖脱氢酶基因GDH分别利用引物对5'C G C C A T A T G A T G A A C C T G C G T G A G A A G T A3'和5' C C G G A A T T C T T A G T A G A A G C T A C C C A T A T A A C G3'以及引物对5' C C G G A A T T C A A G G A G A T A T A C A T A T G A T G T A T A C A G A T T T A A A A G A3'和5' CCGCTCGAGTTAGCCTCTTCCCGTTTGGA3'通过PCR扩增技术获得PCR产物后经过酶切处理，同时插入到表达载体pET22b(+)的Nde I和EcoR I位点以及EcoR I位点和Xho I位点，得到共表达重组质粒pET22b-BHSDH3-GDH。经DNA测序，确定该被克隆的亲本7β-类固醇脱氢酶的核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示，其氨基酸序列如SEQ ID NO：2所示；确定该被克隆的亲本葡萄糖脱氢酶的核苷酸序列如SEQ ID NO：3所示，其氨基酸序列如SEQ ID NO：4所示。
[0031]实施例2
[0032]含有7β-类固醇脱氢酶突变体的共表达重组质粒的制备
[0033]通过反向PCR技术对7β-类固醇脱氢酶亲本进行定点突变，在突变位置通过设计反向引物，利用上下游突变引物扩增目的片段，并在引物上引入相应突变，以重组质粒pET22b-BHSDH3-GDH作为模板进行反向PCR，PCR产物经Dpn I酶消化模板处理后转化到大肠杆菌Rosetta(de3)，经过Amp的筛选后挑取菌落送测序。突变位点及引物设计如表1所示。[0034]PCR体系为：TaKaRa EX Taq HS 0.25ul；10×Ex Taq Buffer 5ul；模板质粒1ul；dNTP(2.5mM each)4ul；上游引物1ul；下游引物1ul；无菌水up to 50ul。
[0035]PCR程序为：首先98℃2min；然后98℃10s，50-65℃30s，72℃7min，30个循环；最后
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