临床医药文献电子杂志
Electronic Journal of Clinical Medical Literature
2019 年 第 6 卷第 48 期2019 Vol.6 No.48
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陈炜烨1*，潘红丽2，欧阳芬1，涂晓欣1
（1.广州中医药大学第二附属医院，广东 广州 510120；2.广州中医药大学，广东 广州 510000）【摘要】目的 探讨CD3+CD4-CD8-T 细胞（DNT 细胞）在系统性红斑狼疮疾病诊断中的价值。方法 流式细胞术检测53例系统性红斑狼疮患者与23例健康体检者外周血T 淋巴亚尤其是DNT 细胞的分布水平。结果 与健康对照组（HC 组）相比，系统性红斑狼疮患者组（SLE 组）的CD3+T%、CD8+T%明显增高，DNT%、CD4+/CD8+比值明显降低，两组间差异具有统计学意义（t =24.08，P =0.000）。结论 后的SLE 组DNT 细胞低于HC 组，可能与SLE 患者服用免疫抑制剂后DNT 细胞含量降低有关。 【关键词】DNT 细胞；T 淋巴亚；系统性红斑狼疮
【中图分类号】R593.2 【文献标识码】A 【文章编号】ISSN.2095-8242.2019.48.131.02
系统性红斑狼疮（Systemic Lupus Erythematosus ，SLE ）是一种累及多系统受损的以自身抗体的产生和免疫复合物的沉积为主要病理特征的慢性难治性自身免疫性疾病，该病临床表现复杂多样，常可引起皮损（蝶形红斑）、关节炎、光过敏、口腔溃疡、脱发、低补体血症、血液系统三系减少，抗核抗体阳性，女性多发，严重影响了患者的生活质量和生存率[1]。SLE 致病机制一直是国内外研究的热点。有研究认为T 淋巴细胞作为信号通路的上游在SLE 疾病的发生发展中发挥着至关重要的作用[2]，而作为新近研究热点CD3+CD4-CD8-T 细胞（Double Negative T Cell ，DNT ，双阴性T 细胞）则因其独特的免疫抑制作用备受 关注。 DNT 细胞是一类新型调节性T 细胞，其特点是既不表达CD4分子，也不表达CD8分子，具有较强的抑制性[3，4]，可针对性地清除具有同样TCR 特异性的已激活的CD8+T 细胞，并诱导抗原特异性免疫耐受[5]。研究表明其含量在正常小鼠及健康人外周血CD3+T 细胞中较低，为1～5%，而在疾病如炎症状态下则显著升高。研究发现，SLE 病人外周血存在显著升高的DNT 细胞，并且在病人肾组织内发现该细胞的蓄积[6]，其浓度水平与SLE 疾病程度呈正相关[7]，而在狼疮小鼠模型中也发现DNT 细胞显著增加[3，8]。
本研究通过流式细胞术检测系统性红斑狼疮患者外周血CD4+T 细胞、CD8+T 细胞、DNT 细胞的分布，以探讨DNT 细胞在SLE 诊断中的价值，为SLE 的诊断提供新的实验室 依据。
1 资料与方法
1.1 一般资料
收集2015年～2019年3月广东省中医院确诊的SLE 患者54例，其中女45例，男9例，平均年龄（33.78±11.30）岁。所有病例均符合1997年美国风湿病学会（ACR ）修订的SLE 分类诊断标准，且有完整的实验室检查记录，但并发以下疾病之一，不作为研究对象：①其他自身免疫性疾病；②恶性肿瘤；③两个月内有输血记录。健康对照组（HC ）为我院健康体检、排除自身免疫性疾病的23例性别、年龄相配者。两组间性别、年龄比均无统计学意义。
1.2 方法
1.2.1 主要仪器与试剂
美国BD FACSCanto II 型流式细胞仪，配套试剂：白细胞分化抗原CD3/CD8/CD45/CD4检测试剂盒（BD Multitest CD3/CD8/CD45/CD4），BD Multitest IMK Lysing Solution 溶血素。
1.2.2 样本处理
流式细胞术检测外周血T 淋巴亚：2 mL EDTA-K2新鲜抗凝血。取20 uL 荧光标记单克隆抗体CD3-FIT
C /CD8-PE/CD45 PerCP/CD4-APC 置入样品测定管，加入50 uL 抗凝全血，震荡混匀，室温下避光孵育15 min ，应用BD Multitest IMK Lysing Solution 溶血素（与去离子水1:10稀释）对样品进行溶血处理，在室温下避光孵育15 min 即可进行流式细胞检测，操作过程中避免管壁上沾有血液以免减少与抗体接触量从而使含淋巴细胞含量相对降低。采用CD45+/SSC 设门，检测CD4+T 细胞、CD8+T 细胞、DNT 细胞，CD4+/CD8+比值。
1.3 统计学方法应用SPSS 2
2.0统计软件对实验数据进行统计分析。定量资料正态分布数据用x ±s 表示，两组比较用独立样本t 检验，多因素采用单因素ANOVA 分析；非正态性数据用中位数（四分位间距）表示，组间比较用秩和检验。以P ＜0.05判断组间差异比较具有统计学意义。
2 结 果
系统性红斑狼疮组（SLE 组）和健康对照组（HC 组）T 淋巴亚比例比较（x ±s ），SLE 组与HC 组相比，CD3+T 细胞、CD8+T 细胞比例明显增高，DNT 细胞比例明显降低，CD4+/CD8+比值降低，差异有统计学意义（P ＜0.05）；CD4+T 细胞两组间比较，差异无统计学意义（P ＞0.05）。结果详见表1。
3 讨 论
DNT 细胞是一种新型调节性T 细胞，可针对性地清除具有同样TCR 特异性的已激活的CD8+T 细胞，并诱导抗原特异性免疫耐受[9]，可能在SLE 的发病机制中起到一定的作用。Crispin JC [6]等研究发现，SLE 病人外周血DNT 细胞水平显著升高，且在病人肾组织内蓄积；也有研究发现DNT 细胞浓度水平与SLE 疾病程度呈正相关，在狼疮小鼠模型动物试验中同样发现DNT 细胞水平显著增加[10，11]。曾文等[12]通过流
基金项目：广东省中医药局（2017KT1184）通讯作者：陈炜烨
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式细胞术对90例活动期SLE患者及90例健康体检者的外周血
淋巴亚进行检测，表明DNT细胞明显高于健康对照组，
CD8+T细胞稍高，CD4+/CD8+比值倒置。
表1 SLE组和HC组T淋巴亚比较（%，X±S）
n CD3+T%CD4+T%CD8+T%CD4+/CD8+DNT% SLE5480.92±11.17#32.24±11.5444.43±12.89#0.84±0.52# 3.35±1.55# HC2369.43±7.2932.29±6.7428.99±7.94 1.22±0.497.49±3.80 t 1.869.04 2.990.12324.08 P0.0000.950.0000.0040.000
本研究比较分析了53例系统性红斑狼疮患者与23例健康对照组外周血DNT细胞比例，结果表明SLE组T淋巴细胞总数、CD8+T%明显升高、CD4+/CD8+比值倒置，跟曾文等研究者结论相同，但DNT细胞含量却低于HC组，跟上述研究结果相反。这可能与本次实验入选患者均接受过免疫抑制剂有关，如甲泼尼松、醋酸羟氯喹联合环磷酰胺或吗替麦考酚酯。有相关研究证实免疫抑制剂的使用会影响T淋巴细胞亚的变化，如张根豪等[13]通过分析免疫抑制剂前后SLE患者外周血T淋巴亚的变化，发现后SLE患者的T细胞亚分布发生改变，CD4+T细胞升高；黎志峰等报道[14]常用免疫抑制剂后SLE患者外周血淋巴细胞亚比例向正常方向调整，从而有效改善了患者淋巴亚失调的病况。
相关研究认为免疫抑制剂的应用导致T淋巴亚的变化可能跟Fas调节机制有关。Fas作为一种凋亡相关蛋白，参与细胞的阴性选择和克隆消除，Fas配体（Fasl）通过与Fas+细胞结合可介导T淋巴细胞凋亡[15]。相关研究表明，SLE患者DNT细胞表面的Fas受体表达显著升高，并随DNT细胞含量升高而升高，但其表达率却显著降低，表明DNT对Fas 介导的凋亡易感性降低，从而逃逸凋亡使DNT细胞含量升高[16]。由此推测本研究中SLE组DNT细胞比例低于HC组，可能由于SLE患者服用免疫抑制剂后，增加了
DNT细胞表面Fas受体的表达率从而促进DNT细胞凋亡而使其含量降低。
因此，本实验结果SLE组DNT细胞比例远低于HC组，可能SLE患者服用免疫抑制剂后通过Fas/Fasl途径促进DNT 细胞凋亡从而使DNT细胞含量降低，而对于其中具体机制，需要后续实验进一步探讨。
参考文献
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本文编辑：赵小龙
性健康安全的首要疾病。经我国卫生部2017年乳腺病调查数据显示，全国发病率较2016年增长40%以上[2]。因而，乳腺疾病应做到早发现、早，避免恶化。一般来讲，患者感觉乳腺出现不明包块后就诊，临床常用检验方法多为彩超、MRI等，尽管检测痛楚低、无创，但无法彻底替代病理检查。而穿刺活检具有创口小、精准度高、操作简单等优势，能够及时进行组织学诊断，预防疾病扩散。通过多点取材可提高疾病检出率[3]。
此次研究中，80例患者均成功完成穿刺取样，成功率为100%，且穿刺病检59例患者包块性质为良性，准确度100%，18例患者包块性质为恶性，准确度85.71%，3例患者包块性质未确诊。分析原因大致为：（1）浸润性包块病变较复杂；（2）穿刺取样时，获取交界处病变组织难度较高；（3）穿刺病检较难判断微小病变组织[4]。因而，采取穿刺病检诊断包块性质时，需结合患者自身感受、病史、影像学资料等进行综合判断，从而提高准确率。
总而言之，以穿刺标本活检诊断乳腺包块准确率较高，对患者伤害低，安全高效，值得推广。
参考文献
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析[J].中国保健营养,2018,28(31):47-48.
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及诊断结果与肿块切除病理诊断结果的差异研究[J].临床医学研究与实践,2016,1(27):41-42.
[4] 刘高.病理活体组织检查在乳腺疾病中的应用价值分析[J].东
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本文编辑：赵小龙
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