(19)中华人民共和国国家知识产权局
(12)发明专利申请
(10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请号 201710981964.2
(22)申请日 2017.10.20
(71)申请人 华中农业大学
地址 430070 湖北省武汉市洪山区狮子山
街1号
(72)发明人 冯武 刘雪 徐晓云 潘思轶
陈加平
(74)专利代理机构 武汉智嘉联合知识产权代理
事务所(普通合伙) 42231
代理人 黄君军
(51)Int.Cl.
A23L 19/20(2016.01)
C12N 1/20(2006.01)
C12N 1/02(2006.01)
(54)发明名称
(57)摘要
本发明提供一种复合乳酸菌接种发酵泡菜
的方法，包括如下步骤：(1)从自然发酵泡菜中筛
选出使菌液pH值维持在3.1-3.3的乳酸菌菌株、 亚硝酸钠降解率在94％-96％的乳酸菌菌株和抑
制大肠杆菌和金黄葡萄球菌的乳酸菌p51和
p52；(2)取步骤(1)中筛选出的乳酸菌p51和p52,
制取p51菌种培养液和p52菌种培养液，将所述
p51菌种培养液和p52菌种培养液离心分离，清除
培养基，分别制得p51菌悬液和p52菌悬液；(3)将
所述p51菌悬液和p52菌悬液按0.5-1.5:1的比例
加入泡菜坛中，用食盐水封坛，在室温下发酵3-4
天，制得泡菜。使用本发明方法制备泡菜，能够缩
短泡菜发酵成熟的周期；亚硝酸盐含量远远低于
国标(GB15198)规定的20mg/kg；能够有效地降低
杂菌污染，
提高泡菜的安全性。权利要求书1页 说明书6页 附图2页CN 107581549 A 2018.01.16
C N 107581549
A
1.一种复合乳酸菌接种发酵泡菜的方法，其特征在于，包括如下步骤：
S1.从自然发酵泡菜中筛选乳酸菌p51和p52：
分离纯化乳酸菌，采集自然发酵泡菜汁液加入MRS肉汤培养基中，在厌氧条件下于37℃富集培养24h，将富集培养所得菌液用无菌水梯度稀释10-5-10-7倍后涂布在含溴甲酚紫的MRS固体培养基平板上，并在37℃进行厌氧培养24h，挑取所述MRS固体培养基平板上使培养基颜变黄的单菌落，在MRS固体培养基平板上采用平板划线法将乳酸菌分离纯化，得到若干单菌落，分别取各单菌落中的菌株进行鉴定，将鉴定确定为乳酸菌的菌株保存备用；
筛选目标乳酸菌，将保存的乳酸菌的菌株活化后用0.85％无菌生理盐水洗菌两次，制备成菌悬液，所述菌悬液按照2％的接种量接入白萝卜汁发酵培养基中置于25℃下厌氧培养，定期取样测定发酵72h过程中的pH值，筛选出乳酸菌发酵液pH值在发酵72小时后维持在
3.1-3.3的乳酸菌菌株；将所述菌液pH值维持在3.1-3.3的乳酸菌菌株按照2％的接种量接种于Na 2NO 2培养基中，置于37℃下厌氧培养，定期取样测定发酵120h过程中的亚硝酸钠含量，监测发酵120h亚硝酸钠的降解率，筛选出亚硝酸钠降解率在94％-96％的乳酸菌菌株；挑取所述菌液pH值维持在3.1-3.3的乳酸菌菌株和亚硝酸钠降解率在94％-96％的乳酸菌菌株进行抑菌实验，筛选出抑制大肠杆菌和金黄葡萄球菌的菌株，得到两株不同的乳酸菌菌株，即目标乳酸菌p51和p52的菌株；
S2.制备菌悬液：
取步骤S1中筛选出的乳酸菌p51和p52，制取p51菌种培养液和p52菌种培养液，将p51菌种培养液和p52菌种培养液分别在转速为4000-6000r/min，温度为4-10℃的条件下离心分离10-20min，清除培养基，分别制得p51菌悬液和p52菌悬液；
S3.制备泡菜：
泡菜坛中加入蔬菜和调料液，将所述p51菌悬液和p52菌悬液按0.5-1.5:1的比例加入泡菜坛中，用食盐水封坛，在室温下发酵3-4天，制得泡菜。
2.根据权利要求1所述的复合乳酸菌接种发酵泡菜的方法，其特征在于，所述步骤S2中制取p51菌种培养液和p52菌种培养液具体包括：取步骤S1中筛选出的乳酸菌p51和p52，接种于MRS琼脂培养基上，于36-38℃恒温下培养22-26h；挑取单菌落接种于MRS液体培养基中，于36-38℃恒温下培养16-20h，分别得到p51菌种培养液和p52菌种培养液。
3.根据权利要求1所述的复合乳酸菌接种发酵泡菜的方法，其特征在于，所述步骤S2中清除培养基的方法具体包括：用0.85％-0.9％无菌生理盐水洗菌1-3次。
4.根据权利要求1所述的复合乳酸菌接种发酵泡菜的方法，其特征在于，所述步骤S3中调料液具体包括以下组分及质量份用量：以冷开水为1000份，大蒜40-50份，辣椒10-15份，八角1-2份，花椒1-2份，食盐40-45份。
5.根据权利要求1所述的复合乳酸菌接种发酵泡菜的方法，其特征在于，所述步骤S3中蔬菜和调料液中冷开水的质量比为0.45-0.5：1。
6.根据权利要求1所述的复合乳酸菌接种发酵泡菜的方法，其特征在于，所述步骤S3中p52菌悬液接种量为1％-2％。
7.根据权利要求1所述的复合乳酸菌接种发酵泡菜的方法，其特征在于，所述步骤S3中食盐水质量浓度为20％-30％。
权 利 要 求 书1/1页CN 107581549 A
一种复合乳酸菌接种发酵泡菜的方法
技术领域
[0001]本发明涉及生物及食品技术领域，更具体地，涉及一种复合乳酸菌接种发酵泡菜的方法。
背景技术
[0002]泡菜，是中国的传统发酵食品之一，广受消费者喜爱，常用来作为佐餐小菜或者开胃菜。许多蔬菜都可以用来制作泡菜，如白菜、萝卜、甘蓝、胡萝卜、豇豆、黄瓜等等。发酵成熟的泡菜具有独特的风味，爽脆的口感，含有丰富的营养物质如维他命、矿物质和膳食纤维等。近年来的研究表明，泡菜具有许多生物活性功能，包括预防便秘和结肠癌，降低血清胆固醇，提高血纤蛋白溶解系统的活性和抗氧化作用，改善免疫功能。
[0003]然而，泡菜生产方法长久以来没有发生实质上的改变，商业生产的泡菜仍然主要依靠自然发酵。但是，自然发酵需要较长的发酵周期，并且容易被环境因素所影响，使得产品品质不一，还容易被杂菌污染，不易大规模生产。亚硝酸盐的累积也是泡菜中普遍存在的问题，尤其是发酵不完全的泡菜。
[0004]专利申请号为200910212643.1的中国发明专利公布了一种纯种发酵盐生蔬菜生产泡菜的方法，该发明的优点在于减少杂菌污染，避免腐烂变质，可减少盐生蔬菜的盐分和苦味，但是并未说明对亚硝酸盐的抑制有明显的结果。而专利申请号为201510585106.7的中国发明专利公布了一种低亚硝酸盐发酵泡菜及其制备方法，该发明的优点在于亚硝酸盐含量低，但该发明需要将泡菜封坛发酵一个月，发酵周期较长。所以解决泡菜生产过程中发酵时间长、易被杂菌污染和亚硝酸盐含量高的问题就显得尤为重要。
发明内容
[0005]本发明旨在解决泡菜自然发酵发酵周期长，亚硝酸盐含量高以及易被杂菌污染等问题，提供一种复合乳酸菌接种发酵泡菜的方法。
[0006]本发明的目的是通过实施如下技术方案来实现的。
[0007]一种复合乳酸菌接种发酵泡菜的方法，具体包括以下步骤：
[0008]S1.从自然发酵泡菜中筛选乳酸菌p51和p52：
[0009]分离纯化乳酸菌，采集自然发酵泡菜汁液加入MRS肉汤培养基中，在厌氧条件下于37℃富集培养24h，将富集培养所得菌液用无菌水梯度稀释10-5-10-7倍后涂布在含溴甲酚紫的MRS固体培养基平板上，
并在37℃进行厌氧培养24h，挑取所述MRS固体培养基平板上使培养基颜变黄的单菌落，在MRS固体培养基平板上采用平板划线法将乳酸菌分离纯化，得到若干单菌落，分别取各单菌落中的菌株进行鉴定，将鉴定确定为乳酸菌的菌株保存备用；[0010]筛选目标乳酸菌，将保存的乳酸菌的菌株活化后用0.85％无菌生理盐水洗菌两次，制备成菌悬液，所述菌悬液按照2％的接种量接入白萝卜汁发酵培养基中置于25℃下厌氧培养，定期取样测定发酵72h过程中的pH值，筛选出乳酸菌发酵液pH值在发酵72小时后维持在3.1-3.3的乳酸菌菌株；将所述菌液pH值维持在3.1-3.3的乳酸菌菌株按照2％的接种
株；挑取所述菌液pH值维持在3.1-3.3的乳酸菌菌株和亚硝酸钠降解率在94％-96％的乳酸菌菌株进行抑菌实验，筛选出抑制大肠杆菌和金黄葡萄球菌的菌株，得到两株不同的乳酸菌菌株，即目标乳酸菌p51和p52的菌株；
[0011]S2.制备菌悬液:
[0012]取步骤S1中筛选出的乳酸菌p51和p52，制取p51菌种培养液和p52菌种培养液，将p51菌种培养液和p52菌种培养液分别在转速为4000-6000r/min，温度为4-10℃的条件下离心分离10-20min，清除培养基，分别制得p51菌悬液和p52菌悬液；
[0013]S3.制备泡菜：
[0014]泡菜坛中加入蔬菜和调料液，将所述p51菌悬液和p52菌悬液按0.5-1.5:1的比例加入泡菜坛中，用食盐水封坛，在室温下发酵3-4天，制得泡菜。
[0015]本发明有以下有益效果：
[0016]本发明提供了一种制备优良泡菜的新方法，该方法采用从泡菜中筛选的乳酸菌接种发酵制备泡菜；并提供一种从自然发酵泡菜中筛选具有优良发酵性能的乳酸菌的方法；使用本发明的方法制备泡菜，能够缩短泡菜发酵成熟的周期；几乎不含亚硝酸盐，远远低于国标(GB15198)规定的20mg/kg；能够有效地抑制有害微生物，降低杂菌污染，提高泡菜的安全性。
附图说明
[0017]图1是自然发酵(sf)和实施例1接种发酵(p51+p52)泡菜卤水的pH变化图；[0018]图2是自然发酵与实施例1接种发酵泡菜总酸含量的变化图；
[0019]图3是自然发酵与实施例1接种发酵泡菜亚硝酸盐含量的变化图；
[0020]图4是自然发酵与实施例1接种发酵泡菜卤水中菌落总数的变化图。
具体实施方式
[0021]下面结合附图和实施例，对本发明的具体实施方式作进一步详细描述。以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。
[0022]本发明提供一种复合乳酸菌接种发酵泡菜的方法，具体地，包括如下步骤：[0023]S1.从自然发酵泡菜中筛选乳酸菌p51和p52：
[0024]分离纯化乳酸菌，采集自然发酵泡菜汁液加入MRS肉汤培养基中，在厌氧条件下于37℃富集培养24h，将富集培养所得菌液用无菌水梯度稀释10-5-10-7倍后涂布在含溴甲酚紫的MRS固体培养基平板上，并在37℃进行厌氧培养24h，挑取所述MRS固体培养基平板上使培养基颜变黄的单菌落，在MRS固体培养基平板上采用平板划线法将乳酸菌分离纯化，得到若干单菌落，分别取各单菌落中的菌株进行鉴定，将鉴定确定为乳酸菌的菌株保存备用；[0025]筛选目标乳酸菌，将保存的乳酸菌的菌株活化后用0.85％无菌生理盐水洗菌两次，制备成菌悬液，所述菌悬液按照2％的接种量接入白萝卜汁发酵培养基中置于25℃下厌氧培养，定期取样测定发酵72h过程中的pH值，筛选出乳酸菌发酵液pH值在发酵72小时后维持在3.1-3.3的乳酸菌菌株；将所述菌液pH值维持在3.1-3.3的乳酸菌菌株按照2％的接种
株；挑取所述菌液pH值维持在3.1-3.3的乳酸菌菌株和亚硝酸钠降解率在94％-96％的乳酸菌菌株进行抑菌实验，筛选出抑制大肠杆菌和金黄葡萄球菌的菌株，得到两株不同的乳酸菌菌株，即目标乳酸菌p51和p52的菌株；
[0026]S2.制备菌悬液：
[0027]取步骤S1中筛选出的乳酸菌p51和p52，制取p51菌种培养液和p52菌种培养液，将p51菌种培养液和p52菌种培养液分别在转速为4000-6000r/min，温度为4-10℃的条件下离心分离10-20min，清除培养基，分别制得p51菌悬液和p52菌悬液；
[0028]S3.制备泡菜：
[0029]泡菜坛中加入蔬菜和调料液，将所述p51菌悬液和p52菌悬液按0.5-1.5:1的比例加入泡菜坛中，用食盐水封坛，在室温下发酵3-4天，制得泡菜。
[0030]具体地，所述步骤S2具体包括：取步骤S1中筛选出的乳酸菌p51和p52，接种于MRS 琼脂培养基上，于36-38℃恒温下培养22-26h；挑取单菌落接种于MRS液体培养基中，于36-38℃恒温下培养16-20h，分别得到p51菌种培养液和p52菌种培养液。
[0031]具体地，所述步骤S2清除培养基的方法具体包括：用0.85％-0.9％无菌生理盐水洗菌1-3次。
[0032]具体地，所述步骤S3加入蔬菜和调料液具体包括：所述步骤S3中调料液具体包括以下组分及质量份用量：以冷开水为1000份，大蒜40-50份，辣椒10-15份，八角1-2份，花椒1-2份，食盐40-45份。
[0033]具体地，所述步骤S3中蔬菜和调料液中冷开水的质量比为0.45-0.5：1。
[0034]具体地，所述步骤S3中p52菌悬液接种量为1％-2％。
[0035]具体地，所述步骤S3中食盐水质量浓度为20％-30％。
[0036]上述方法中MRS肉汤培养基配方：蛋白胨10.0g、牛肉粉8.0g、酵母粉4.0g、葡萄糖20.0g、磷酸氢二钾2.0g、柠檬酸氢二铵2.0g、乙酸钠5.0g、硫酸镁0.2g、硫酸锰0.04g、吐温-80 1.0g、蒸馏水1L，使用前需要在121℃灭菌20min，最终pH值为5.7±0.2。
[0037]上述方法中乳酸菌菌株鉴定方法为：分别取分离的菌株使用革兰氏染试剂盒进行革兰氏染，在油镜4×100下观察单菌落形态；分别挑取上述单菌落于载玻片上，滴加3％过氧化氢溶液，观察是否有气泡产生。若有气泡产生，则为接触酶阳性，否则为接触酶阴性。若菌株革兰氏染阳性，过氧化氢酶试验阴性则说明筛选出来的菌株为乳酸菌菌株，将鉴定确定为乳酸菌的菌株保存备用。
[0038]实施例1：
[0039] 1.从自然发酵泡菜中筛选乳酸菌p51和p52：
[0040](1)采集自然发酵泡菜汁液加入MRS肉汤培养基中，在37℃恒温箱中培养，在厌氧条件下富集培养24h，将富集培养所得菌液用无菌水梯度稀释至10-1、10-2、10-3、10-4、10-5、10-6、10-7，分别取稀释至10-5、10-6、10-7的菌液涂布在含溴甲酚紫的MRS固体培养基平板上并在37℃进行厌氧培养24h，
挑取所述平板上使培养基颜变黄的单菌落在MRS固体培养基平板上采用平板划线法将乳酸菌分离纯化，得到若干单菌落。
[0041]分别对各单菌落中的菌株进行鉴定：分别取分离的菌株使用革兰氏染试剂盒进
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