技术领域
本发明属于生物技术领域，涉及一种奥沙西泮半抗原、奥沙西泮抗原及其制备方法和应用。
背景技术
奥沙西泮(Oxazepam)为苯二氮卓类镇静，别名：舒宁，化学名称为：7-氯-2,3-二氢-3-羟基-5-苯基-1,4(2H)-苯并二氮杂卓-2-酮。奥沙西泮是的主要活性代谢产物，属于短效苯二氮卓类药物。在临床上，奥沙西泮用于焦虑症及焦虑症相关的失眠给予短期，奥沙西泮对肝功能的影响比较少，比较适合老年人患者、肝脏疾病患者。很多患者长期服用奥沙西泮片会产生依赖性，停药后会出现戒断反应。为此许多国家将此类药物列入禁用药物名单，严格管制。目前，国内外有关奥沙西泮的检测主要有高效液相谱法(HPLC)、气相谱法(GC)、薄层谱法(TLC)、气-质联用法(GC-MS)、液-质联用法(LC-MS)等。 CN107271599A公开了一种人唾液中及其代谢物的在线SPE-LC-MS/MS分析方法，该分析方法中唾液样品采用在线固相萃取，谱分离采用C18谱柱，以流动相水(含2mmol/L甲
酸铵和0.1％甲酸)和流动相乙腈(含2mmol/L甲酸铵和0.1％甲酸)梯度洗脱；质谱采用电喷雾电离(ESI)，多反应监测(MRM)模式检测目标化合物。该发明首次建立了一个简单、灵敏、稳定的、全自动的在线SPE-LC-MS/MS方法用来定量人唾液中的及其5种代谢物(去甲西泮、奥沙西泮、、奥沙西泮葡萄糖醛酸结合物和葡萄糖醛酸结合物)。
CN109085265A公开了一种液相谱串联质谱法检测血清血浆中抗焦虑/催眠类药物的试剂盒，包括：药物标准品：，，，，，硝西泮，奥沙西泮，；药物内标化合物：阿普唑仑-d5，-d4，-d5，-d4，-d4，硝西泮-d5，奥沙西泮-d5，-d5；药物萃取组合物：体积占比为60％的甲醇溶液，20％的乙腈溶液，10％的异丙醇溶液以及10％的纯化水；阴性血浆；以及稀释剂：50％甲醇水溶液，所述试剂盒可被用于同时检测抗焦虑/催眠类药物及其活性代谢物，并且其检测时间短通量大。
但这些方法不仅需要昂贵的仪器设备，对检材的要求也比较高，需要进一步的提纯处理才能进行，这已经不能达到现代检测对快速、方便、准确的要求。为了加强对此药物的监管力度和保障人民的身体健康，有必要展开关于苯二氮卓类免疫分析方法的研究，有必要提供一种有效的奥沙西泮人工抗原的制备方法。
发明内容
针对现有技术的不足，本发明的目的在于提供一种奥沙西泮半抗原、奥沙西泮抗原及其制备方法和应用，具体包括奥沙西泮半抗原及其制备方法，奥沙西泮抗原及其制备方法，奥沙西泮半抗原或奥沙西泮抗原在对样本中的苯二氮卓类化合物进行免疫检测中的应用，以及一种检测样本中苯二氮卓类化合物的免疫层析试剂盒。
为达到此发明目的，本发明采用以下技术方案：
第一方面，本发明提供一种奥沙西泮半抗原，所述奥沙西泮半抗原的结构如式(Ⅰ)所示：
其中，x为2-6的任一整数，例如x＝2、3、4、5或6；y为x的2倍。
本发明提供了一种新型的奥沙西泮人工抗原，可适用于对苯二氮卓类化合物特别是奥沙西泮的免疫分析，提高了苯二氮卓类化合物检测的速度、便利性和准确性。本发明制备的抗原可降低检测试剂盒的交叉物干扰、提高对苯二氮卓类药物的检出率，并能应用于毛发检材的试剂盒，提高检测灵敏度至3ng/ml，为同类产品中灵敏度最高的。
第二方面，本发明提供一种如上所述的奥沙西泮半抗原的制备方法，所述奥沙西泮半抗原的制备方法包括：以奥沙西泮、二酐为原料，采用傅克酰化反应，在奥沙西泮的5位苯环上引入羧基，得到所述奥沙西泮半抗原；所述二酐包括丁二酸酐、戊二酸酐、己二酸酐、庚二酸酐或辛二酸酐。
本发明所涉及的奥沙西泮半抗原的合成方法主要涉及的关键因素是奥沙西泮分子结构中引入羧基，本发明经多种合成方案筛选后，采用傅克酰化反应，羧基化工艺条件温和，无需高温高压，操作简单，反应收率高。
优选地，所述反应中使用催化剂。
优选地，所述二酐与催化剂的摩尔比为1:(1-3)，例如1:1、1:1.5、1:2、1:2.5或1:3等，上述范围内的其他具体点值均可选择，在此便不再一一赘述。
此处二酐与催化剂的摩尔比特定选择为1:(1-3)的数值范围，是因为若催化剂的占比低于此范围会酰基化不完全，反应物反应不完全导致浪费；若催化剂的占比高于此范围酰基、酸根离子都会与催化剂络合。
优选地，所述催化剂包括氯化铝。
本发明优选氯化铝作为合成反应的催化剂，是因为氯化铝相对于其他Lewis酸催化活性更高，并且容易获取。Lewis酸催化剂的催化活性：AlCl 3＞FeCl 3＞SbCl 3＞BF 3＞TiCl 4＞ZnCl 2。
优选地，所述奥沙西泮与二酐的摩尔比为1:2-2:1，例如1:2、2:3、1:1、3:2或2:1等，上述范围内的其他具体点值均可选择，在此便不再一一赘述。
此处奥沙西泮与二酐的摩尔比特定选择为1:2-2:1，是因为若二酐的添加量低于上述范围，主要反应物奥沙西泮大量未参与反应而浪费，若二酐的添加量高于上述范围会使傅克反应中产生的酰基、酸根离子与三氯化铝的络合。
优选地，所述反应在无水介质中进行。
优选地，所述无水介质包括二氯甲烷、、四氯化碳、乙醚或丙酮中的任意一种或至少两种的组合；所述至少两种的组合例如二氯甲烷和的组合、四氯化碳和乙醚的组合、乙醚和丙酮的组合等，其他任意的组合方式均可选择，在此便不再一一赘述。优选二氯
甲烷。
上述合成反应优选二氯甲烷作为反应介质的原因是二氯甲烷在低温时也不会混入空气中的水；在反应结束后，二氯甲烷更容易去除，并且毒性低。
优选地，所述反应的温度为15-35℃，例如15℃、20℃、22℃、25℃、30℃或35℃等，时间为10-24h，例如10h、12h、15h、18h、20h或24h等，上述范围内的其他具体点值均可选择，在此便不再一一赘述。
当本发明所涉及的奥沙西泮半抗原的制备方法满足上述温度、时间、原料比例、催化剂和介质的要求时，反应的效率更高，奥沙西泮半抗原的收率更高。
第三方面，本发明提供一种奥沙西泮抗原，所述奥沙西泮抗原是由如第一方面所述的奥沙西泮半抗原制备得到的。
本发明所涉及的奥沙西泮半抗原通过与载体蛋白的偶联而活化，带有载体蛋白的修饰性抗原具有更强的免疫活性，因为单独的小分子本身通常不具有免疫活性或免疫活性很低。
第四方面，本发明提供一种如上所述的奥沙西泮抗原的制备方法，所述制备方法包括：将奥沙西泮半抗原进行活化后，与载体蛋白进行偶联反应，得到所述奥沙西泮抗原。
优选地，所述奥沙西泮半抗原活化的方式为：将奥沙西泮半抗原与N-羟基琥珀酰亚胺和1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐混合反应，得到活化的奥沙西泮半抗原。
优选地，所述奥沙西泮半抗原、N-羟基琥珀酰亚胺和1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐的摩尔比为1:(1-1.5):(1-1.5)，例如1:1:1、1:1:1.5、1:1.5:1、1:1.5:1.5、1:1.2:1、1:1:1.2或1:1.2:1.2等，上述范围内的其他具体点值均可选择，在此便不再一一赘述。
优选地，所述反应的反应介质包括N,N-二甲基甲酰胺。
优选地，所述载体蛋白包括牛血清蛋白、卵清蛋白、血蓝蛋白、牛血红蛋白、牛甲状腺蛋白、人免疫球蛋白IgG或人免疫球蛋白IgA。
优选地，所述偶联反应的体系pH值维持在9.4-9.8，例如pH＝9.4、pH＝9.5、pH＝9.6、pH＝9.7或pH＝9.8等，上述范围内的其他具体点值均可选择，在此便不再一一赘述。
优选地，所述偶联反应的温度为2-6℃，例如2℃、3℃、4℃、5℃或6℃等，时间为10-24h，例如10h、12h、15h、18h、20h或24h等，上述范围内的其他具体点值均可选择，在此便不再一一赘述。
优选地，所述偶联反应结束后，将反应混合物进行透析纯化，透析液为0.05M，pH7.4的PBS缓冲液。
当本发明所涉及的奥沙西泮抗原的制备方法满足上述温度、时间、原料比例、体系pH环境、介质的要求时，反应的效率更高，奥沙西泮抗原的收率更高。
第五方面，本发明提供如上所述的奥沙西泮半抗原或如上所述的奥沙西泮抗原在对样本中的苯二氮卓类化合物特别是奥沙西泮进行免疫检测中的应用。
优选地，所述样本包括体液样本或组织样本。
本发明合成的奥沙西泮半抗原或者奥沙西泮抗原可以被用来利用免疫反应检测样本中是否含有苯二氮卓类物质。这里的样本是指哺乳动物或者人的体液样本，例如唾液、尿液、汗液；或者，哺乳动物或者人的组织样本，例如毛发、肝脏、脾等组织。这里所谓的“免疫检测方法
”是利用抗体与抗原的结合的原理进行的免疫分析或者检测方法，这种免疫方法包括酶联免疫法(ELISA)，也包括横向流动测试试纸法(Lateral Flow)，方法包括竞争方法。
横向流动测试试纸用吸水或者非吸水性材料制成，一个测试条可以用多种材料，用于液体的传递。测试条的一种材料可以叠加在另一种测试条材料上，例如滤纸叠加在硝化纤维上。或者，测试条中至少含有一种材料的一个区域位于另一种至少含有一种不同材料的区域之后。在这种情况下，各区域之间的液体是可以流通的，它们之间可以相互叠加或者不叠加。测试条上的材料可以固定在例如塑料衬片的支撑物上或者硬质表面，以加强测试条可持力。测试条各区域可按如下排列：加样区，至少一个试剂区，至少一个检测结果区，至少一个控制区，至少一个掺假检测区和液体吸收区。如果检测区包括一个控制区，优选控制区位于检测结果区的被分析物检测区之后。所有这些区或其组合可以含有一种材料的单一试纸上。另外，这些区由不同的材料制成，并按液体传递的方向连接在一起。例如，不同区域可以直接或者间接进行液体传递。
第六方面，本发明提供一种检测样本中苯二氮卓类化合物的免疫层析试剂盒，所述免疫层析试剂盒包括样品垫、标记垫、硝酸纤维素膜、吸水板和底板；所述硝酸纤维素膜包括被如上所述的奥沙西泮抗原包被的检测线和被羊抗鼠抗体包被的质控线。
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