㊀㊀2023年第64卷第6期
1503收稿日期:2022-07-19
基金项目：宁波市科技局农业重大项目(2016C11009)
作者简介：王利平(1982 )，女，高级工程师，硕士，从事林业技术推广工作,E-mail:42510476@qq㊂通信作者：焦云(1983 )，男，河北石家庄人，副研究员，主要从事果树分子遗传育种与栽培技术研究㊂ 文献著录格式：王利平，沈颖，陈荣锋，等.蓝莓基因组SSR 分子标记开发[J].浙江农业科学,2023,64(6):1503-1506.DOI: 10.16178/j.issn.0528-9017.20220789
蓝莓基因组SSR 分子标记开发
王利平1，沈颖1，陈荣锋1，焦云2∗
(1.宁波余姚市林业技术服务中心，浙江宁波㊀315400;2.宁波市农业科学研究院林业研究所，浙江宁波㊀315040)
㊀㊀摘㊀要：基于蓝莓(Vaccinium spp.)基因组DNA 开发简单重复序列(simple sequence repeats,SSR)分子
标记25对，并采用17份蓝莓试材评价其多态性，结果表明，上述SSR 位点的等位基因数量介于3~9个，平均等位基因数约为4.96个，信息指数平均值为1.0552㊂此外，遗传多样性分析结果表明,17份蓝莓试材被分为4
个组；其中,A 组包含12份蓝莓试材，为最大分支；而C 组和D 组分别仅包含1份蓝莓试材，其遗传亲缘关系与其他试材相距较远㊂本研究开发的SSR 引物能为蓝莓遗传多样性研究㊁新品种鉴定提供借鉴㊂
关键词：蓝莓；基因组;SSR；分子标记
中图分类号:S663.9㊀㊀㊀文献标志码:A㊀㊀㊀文章编号:0528-9017(2023)06-1503-04
㊀㊀蓝莓(Vaccinium spp.)为杜鹃花科(Ericaceae)
越橘属(Vaccinium )小浆果果树，原产于北美地区,
在我国境内东北㊁西北和华东等地山区均有分布[1]㊂由于我国蓝莓品种选育及栽培起步较晚，在生产上的栽培品种仍然以欧美等国家的为主，主要分为高丛蓝莓㊁矮丛蓝莓和兔眼蓝莓3个类，品种繁多，其种质资源遗传背景差异较大[2]㊂
近年来,DNA 分子标记技术发展迅速,SSR㊁相关序列扩增多态性(sequence-related amplified
polymorphism,SRAP )和扩增片段长度多态性(amplified fragments length polymorphism,AFLP )等已广泛应用于桃[3-4]㊁葡萄[5]和番石榴[6]等果树遗传多样性分析和指纹图谱的绘制㊂在蓝莓的遗传
背景研究中，基于表达序列标签开发简单重复序列
的一种新型分子标记(expressed sequence tags-SSR,EST-SSR)应用相对较多㊂相关研究表明，相对于EST-SSR，基因组DNA 中的SSR 具有更高的多态性，在不同品种间的通用性更高[7]㊂因此，本研究基于蓝莓基因组DNA 序列，鉴定出SSR 位点并进行引物设计，综合评价其多形态，旨在为蓝莓遗传多样性分析，品种指纹图谱构建和分子标记辅助选择育种奠定基础㊂1 材料与方法1.1㊀材料
于2022年4月14日采集表1中蓝莓植株样品
嫩叶，使用Ezup 柱式植物基因组DNA 抽提试剂盒
(上海，生工生物工程股份有限公司)提取其基因组DNA 存于-80ħ冰箱备用㊂
表1㊀本研究中17份蓝莓试材相关信息
编号品种名称遗传类型果型大小来源
1余蓝2号高丛大果中国，浙江2余蓝1号高丛大果中国，浙江3酷派高丛中果美国4玉兰
高丛中果美国5莱格西高丛大果美国6艾文蓝高丛中果美国7威尔高丛中小果美国8斯巴坦
高丛极大果美国9
追雪高丛中大果美国10天后高丛大果美国11红粉佳人兔眼中果美国12奥尼尔高丛大果美国13灿烂兔眼中大果美国14海岸高丛中大果美国15园蓝兔眼小果美国16蓝莓-M 高丛大果
中国，浙江17优瑞卡
高丛
极大果
新西兰
1.2㊀方法
㊀㊀基于LINUX 计算机环境，下载蓝莓Vaccinium corymbosum (eudicots )基因组DNA 序列
(bi.v /assembly /GCA _
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014504835.1/)，使用MISA和Primer3( webblast.ipk-gatersleben.de/misa/)脚本对上述序列中SSR位点进行筛选并设计相应的引物；从中选择引物扩增产物长度在100~200bp㊁退火温度60ħ的引物25对，委托生工生物工程(上海)股份有限公司合成，其5ᶄ端分别添加M13通用引物序列(TGTAAAACGACGGCCAGT)㊂
此外，基于表1中样品基因组DNA，使用试剂盒Taq PCR Master Mix(上海，生工生物工程股份有限公司)并参照其说明书进行PCR扩增；扩增产物取适量交于生工生物工程(上海)股份有限公司在ABI3730遗传分析仪上进行基因型分型检测，然后使用Microsoft Excel2016构建数据矩阵表；利用软件POPGENE1.32计算所有引物组合的Shannon信息指数和有效等位基因数；基于非加权组平均法(UPGMA)，使用软件Free Tree 0.9.1.50进行聚类分析(bootstrap=1000)，聚类图使用软件Tree view1.6.6进行编辑和结果展示㊂2 结果与分析
2.1㊀SSR引物多态性分析
㊀㊀使用17份蓝莓试材对上述SSR引物进行多态性评价分析，结果共扩增出124个条带，平均每个引物可扩增约5个条带(表2)㊂此外，平均有效等位基因位点数量和Shannon信息指数分别为2.5069和1.0552㊂每个引物组合扩增条带数量范围为3~9；其中,J00001.10和J04514.1可扩增出条带数量最多，均为9个，其有效等位基因位点数量分别为4.7769和3.6125;Shannon信息指数分别为1.7975和1.6608㊂
表2㊀蓝莓SSR引物组合多态性信息表
引物名称引物序列
扩增片段
片段范围片段数量
N e I
J00001.10F:TGTAAAACGACGGCCAGTAGCTAGTCATTGGGTGCGATTT192~2129 4.7769 1.7975 R:CCTCCTTCCAACCTCCTATGA
J00001.24F:TGTAAAACGACGGCCAGTCGTCCGCAATGTAGATGGGTTT145~1995 2.2898 1.0784 R:CCGAGCCGTGCATTGTCAAAAT
J00406.1F:TGTAAAACGACGGCCAGTTTGGGTTCGATGGGTTCACACA202~2545 2.6235 1.1423 R:GGAGCCAGGGGTGCCAATTAT
J00415.4F:TGTAAAACGACGGCCAGTCTCGGCACCTGAGGAACAATAT162~2245 2.4453 1.1095 R:TTGCATAGTCTGAGCTCATTAA
J00417.6F:TGTAAAACGACGGCCAGTACCACCCGTTTCTTAAGCAACT198~2514 2.12460.9234 R:AGCTTGCAGTTACAGCCCTTGA
J00424.5F:TGTAAAACGACGGCCAGTCGTGTCGTTATTGCCCGTAATC187~2153 1.11920.2531 R:TCGGAGAGAGAGAGGGAAATTC
J01171.4F:TGTAAAACGACGGCCAGTCTTGGGACTTTGGGGCGTAATT137~1713 1.11920.2531 R:AAGGCCCAACAACAAAAGGAAA
J01208.3F:TGTAAAACGACGGCCAGTTCCTTGCACGCTCAGGATGGG189~2214 1.33330.5349 R:GCGCCAAGTGAACACCCTAGTT
J01214.4F:TGTAAAACGACGGCCAGTTCTACCCCGGACGTCAGAAATT174~2405 1.33880.5880 R:TCCGGCTATTGGATCACATGAA
J01784.1F:TGTAAAACGACGGCCAGTTGAAGAGCAAGACGACGATGAA135~2017 2.6235 1.2784 R:TCAGAAGAACCACCAGCAGCAG
J04815.1F:TGTAAAACGACGGCCAGTCCAGCCGAGGAGACCAAGAAT176~1926 5.7228 1.7682 R:ACACACACTCACTACACATACA
J00149.13F:TGTAAAACGACGGCCAGTGGCAGTCACACTAACCACTCTG206~2143 1.70500.7181 R:GTTCGTTTGTCCTTGTCATTCT
J00151.17F:TGTAAAACGACGGCCAGTTCACCACATTTCGTCGCCATAG134~1435 2.6806 1.2546 R:TGTTGCTGAATCCATGCGAAAG
J00164.8F:TGTAAAACGACGGCCAGTAAGGTTAGTGGCAGGGTCAAAA151~1565 2.03620.9995 R:GGAGTGCCACAATGAGATTTCT
J00177.9F:TGTAAAACGACGGCCAGTGCGGTACACACACACACACACA131~1637 2.5473 1.3197 R:AGGGCTGGGGTACTTGATTTGA
J00222.11F:TGTAAAACGACGGCCAGTCTGACATGCGCAACGAAAATCC191~2144 2.8473 1.1791 R:TTGCCATGGACGGTCGGAGA
表2(续)
引物名称引物序列
扩增片段
片段范围片段数量
N e I
J00546.2F:TGTAAAACGACGGCCAGTAGCCCTGTTAGTGATGGTTTCG153~1663 2.19660.8626 R:GGCCTGCCCAACTAGATAGAT
J00554.4F:TGTAAAACGACGGCCAGTTAGCAAGTGGAGTGGTAGCCA175~1834 2.4810 1.0575 R:GCCCACCCCTTGTAGCATGGTA
J00564.5F:TGTAAAACGACGGCCAGTCGCGAAAACCCATCCTGCAATA115~1553 2.11070.8004 R:GAATTCTGCACGTCCCAAATTA
J00018.42F:TGTAAAACGACGGCCAGTGGGGCCTTCTTCCTCTCGATTC201~2144 2.35640.9748 R:GCACGTCACCTCAACTCCTATT
J00051.4F:TGTAAAACGACGGCCAGTGTTGGTTGGTGGGGTTGCTTCC141~1975 3.1610 1.3180 R:AGGGGTGTCAGGGCCAGTTTAC
J00497.8F:TGTAAAACGACGGCCAGTGGGCCTCCATACCTTGCTGAAA177~2315 2.6759 1.1779 R:TCGGATGGGTGGTGAGTGAATT
J00757.2F:TGTAAAACGACGGCCAGTTCCCCGAGCTCAATCTGTACAT137~1525 2.3394 1.1236 R:AGGCTTTCAAACACTCCCTAAA
J01512.7F:TGTAAAACGACGGCCAGTCGCCGCCCCTCTCACTCTTC177~2316 2.4049 1.2069 R:AGCGTTGCAGTGATGTGGAGAA
J04514.1F:TGTAAAACGACGGCCAGTCGCTCCCCTACGGCTCAGAAA130~1609 3.6125 1.6608 R:TGGCTCGAAGTCCAACGCTTCT
平均 4.96 2.5069 1.0552总计124
㊀㊀注:N e 有效等位基因数;I Shannon遗传多样性指数㊂
2.2㊀基于SSR分子标记的蓝莓遗传多样性分析㊀㊀基于25对SSR引物的分型结果，并采用UPGMA法构建17份蓝莓试材的遗传亲缘关系聚类树(图1)㊂结果表明,17份蓝莓试材分为4组,
bootstrap=1000，仅显示50以上的分支置信度数值㊂
图1㊀基于25对SSR分子标记分型矩阵及采用UPGMA构建的17份蓝莓试材聚类树其㊀㊀
中,A组包含12份试材;B组包含3份试材；此外,C组和D组分别只包含1份试材，分别是蓝莓-M和优瑞卡，这意味着它们可能有着更为特异的遗传来源㊂
3 讨论
我国蓝莓的分子生物学研究起步较晚，仍然滞后于其他作物㊂在蓝莓的遗传背景研究中,EST-SSR标记应用相对较多[8]㊂徐国辉等[9]利用8个自然杂交蓝莓优良品系评价EST-SSR引物组合多形态，结果检测出等位基因平均为2.3个,Shannon 多样性指数均值为0.7003，均低于本研究中相关数据结果；相反的，耿金曼[10]利用13个蔓越橘品种评价EST-SSR标记多态性，结果发现,EST-SSR 位点平均每对引物检测到等位基因数为10.29个，高于本研究中相关数据结果㊂由此可见，不同SSR 之间多态性差异较大，这也可能与选择评价试材的遗传背景差异大小有关㊂
此外，余蓝1号和余蓝2号均为课题组前期杂交选育的蓝莓品种，其果型较大，由图1可知，其遗传来源属于A组，与酷派㊁玉兰和莱格西同属于一个分支㊂总体而言，遗传多样性聚类结果与果实果型大小的联系不明显㊂值得注意的是，超大果型蓝莓优瑞卡与其他品种遗传亲缘关系较远，并属
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于单独分支D组，可见其具有更为特异的遗传来源，其果型分子遗传机制还有待进一步探索㊂总之，在后续的研究中，应该加强功能性分子标记的研究力度，借以推进分子辅助育种，缩短育种进程㊂
参考文献:
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(5):1580-1589.
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(责任编辑：董宇飞)
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