(19)中华人民共和国国家知识产权局
(12)发明专利申请
(10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请号 201810461431.6
(22)申请日 2018.05.05
(71)申请人 杨永鹏
地址 116000 辽宁省大连市高新园区世达
街4号
申请人 谭铖洸 丁克祥
(72)发明人 滕肇慧 谭铖洸 杨永鹏 董萍
丁克祥 朱晓亮 左夏林 丁宇
(74)专利代理机构 长沙科明知识产权代理事务
所(普通合伙) 43203
代理人 彭乃恩
(51)Int.Cl.
A61K 8/64(2006.01)
A61K 8/06(2006.01)
A61Q 19/00(2006.01)
C07K 7/08(2006.01)C07K 1/16(2006.01)C07K 1/06(2006.01)C07K 1/04(2006.01)
(54)发明名称一种穿膜肽-乙酰基六胜肽纳米乳及其制备方法(57)摘要本发明涉及皮肤抗老化和美容护肤保健及日用化妆品等领域，是一种可透皮吸收的穿膜肽-乙酰基六胜肽纳米乳及其制备方法。先设计并人工合成穿膜肽-乙酰基六胜肽再制备其纳米乳。发明采用纳米乳和穿膜肽修饰技术协同效应以提高乙酰基六胜肽经皮渗透能力和透皮吸收效果，从而减少该肽降解，维持肽分子结构稳定和生物活性，提高以该肽作为美容目的药物或功效成分的溶解性和有效性。穿膜肽修饰乙酰基六胜肽纳米乳，降低易致皮肤刺激和过敏的S/C可提高应用安全性和舒适性性，且产品制备均在常温进行，无需加热及提供能量，无需特殊设备即可大量生产，既利于产业化，又利于环境保护和 节省能源。权利要求书2页 说明书16页 附图5页CN 108714111 A 2018.10.30
C N 108714111
A
1.一种穿膜肽-乙酰基六胜肽纳米乳及其制备方法，其特征在于它是由以下原料组成及其重量百分比范围如下：
肉豆蔻酸异丙酯7.32％-10.75％、辛酸癸酸聚乙二醇甘油酯17.53％-20.12％、聚甘油脂肪酸酯5.84％-6.71％、重蒸馏水64.54％-68.97％、穿膜肽-乙酰基六胜肽0.01％-0.2％。
2.根据权利要求1所述的一种穿膜肽-乙酰基六胜肽纳米乳制备的各原料优选的最佳重量百分比是：
肉豆蔻酸异丙酯7.66％、辛酸癸酸聚乙二醇甘油酯17.53％、聚甘油脂肪酸酯5.84％、重蒸馏水68.87％、穿膜肽-乙酰基六胜肽0.1％。
3.根据权利要求1所述的一种穿膜肽-乙酰基六胜肽纳米乳的制备方法，其特征在于它包括以下步骤：
第一，设计穿膜肽-乙酰基六胜肽的分子结构及其序列、并进行人工合成：本发明设计并合成的穿膜肽-乙酰基六胜肽是含有17个氨基酸的短肽，其氨基酸组成及分子结构序列为Ac-EEMQRRYGRKKRRQRRR，人工合成的方法采用化学固相合成法。其具体人工合成方法是：(1)称取二氯树脂1.5g(合成目的肽为0.08mmol，所用二氯树脂的取代度为0.4mmol/g，按照7.5倍过量，则所需的二氯树脂质量为0.08/0.4*7.5＝1.5g)，放入反应柱里，然后在反应柱里加入20毫升DCM(二氯甲烷)，振荡30min，完成二氯树脂的溶胀和活化待用。(2)通过沙芯抽滤掉DCM(二氯甲烷)溶剂，加入1.05倍树脂摩尔量的Fmoc-L-Arg(Pbf)-OH(精氨酸)，再加入10倍树脂摩尔量的DIEA(N，N-二异丙基乙胺)，最后加入少量的DMF(N，N-二甲基甲酰胺)溶解，振荡1h。反应完后用DMF(N，N-二甲基甲酰胺)和DCM(二氯甲烷)交替清洗6遍，完成首个氨基酸的连接。(3)加入20毫升20％/DMF溶液，5min后抽掉。再加 入20毫升20％/ DMF溶液，振荡15min，完成其脱保护反应。(4)抽掉溶液，取十几粒树脂，用乙醇洗三次，加入茚三酮，吡啶，苯酚各一滴，105℃-110℃加热5min，变深蓝为阳性反应，如非阳性反应，则需要重新进行脱保护。(5)依次用15毫升DMF，15毫升甲醇，15毫升DMF分别清洗两次。
(6)加入3倍树脂摩尔量的Fmoc-L-Arg(Pbf)-OH，3倍树脂摩尔量的HBTU，均用少量的DMF溶解，立刻加入10倍树脂摩尔量的DIEA，反应30min。(7)再依次用15毫升DMF，15毫升甲醇，15毫升DMF分别清洗两次。(8)按照以上方法重复进行操作，即按照本发明穿膜肽-乙酰六胜肽的氨基酸结构序列Ac-EEMQRRYGRKKRRQRRR，依次接完剩余氨基酸的连接，从而完成该肽链的延长。(9)再在反应柱里加入3倍树脂摩尔量的乙酸酐，3倍树脂摩尔量的吡啶，反应30min。乙酰基(AC)接上后，整条肽的合成就反应完成了。进入最后的收缩阶段，由于AC没有Fmoc保护，所以此处就无需脱保护了。肽的收缩：用DMF洗涤反应3遍，DCM洗涤反应3遍，甲醇洗涤反应3遍，最后抽干肽树脂。(10)氨基酸侧链脱保护与树脂的切割采用含有的侧链保护基有：Pbf、Trt、Boc、Tbu，这几种保护基在酸性条件下不稳定，而切割树脂用的是TFA，所以脱保护和切割树脂可以同时进行。配置切割液15ml，其中各组分的体积比为：TFA(94.5％)、水(2％)、EDT(2.5％)、TIS(1％)。将树脂装入烧瓶中，恒温(30℃)振荡2h。将裂解液用氮气尽量吹干，然后倒入离心管中，缓慢倒入乙醚。封口并放入离心机中离心5min，倒掉上清液，下方为白固体。再用乙醚洗6次，然后常温挥干，即得粗品肽。(11)采用HPLC方法进行纯化，即：①溶解：将粗品肽放入器皿中，用30-50ml浓度为50％的乙腈水溶液完全溶解，可以稍微超声2min。②过滤：用0.45μm滤膜过滤溶解液。③分析：取3μl溶液用分析级HPLC分析粗
品以便于后续制备。流动相是水和乙腈，时间30min，梯度洗脱，先将HPLC用起始梯度平衡5min然后进样，起始梯度为：水95％，乙腈5％，结束梯度为：水5％，乙腈95％。④制备：将溶解好的样品做进样准备。制备HPLC平衡10min，起始梯度为：水95％，乙腈5％，结束梯度为：水25％，乙腈75％，梯度时间40min。收集从检测器出来的样品。⑤鉴定：将收集的样品进行取样并做纯度和质谱的鉴定。
第二，设计的一种穿膜肽-乙酰基六胜肽纳米乳的原料组方及其比例、并进行实验室制备。这种穿膜肽-乙酰基六胜肽纳米乳的制备方法如下：
1)按穿膜肽-乙酰基六胜肽纳米乳原料的配比，将肉豆蔻酸异丙酯作为油相(A)备用；
2)将穿膜肽-乙酰基六胜肽、适量蒸馏水混合使之完全溶解，再加蒸馏水使之作为水相
(C)备用；
3)将辛酸癸酸聚乙二醇甘油酯、聚甘油脂肪酸酯等于3∶1的比例，置于另一容器之中，充分搅拌均匀，使之形成辛酸癸酸聚乙二醇甘油酯、聚甘油脂肪酸酯混合物(B)备用；
4)再将油相(A)∶辛酸癸酸聚乙二醇甘油酯、聚甘油脂肪酸酯混合物(B)∶水相(C)等于7.66∶23.37∶68.97的比例，分别取辛酸癸酸聚乙二醇甘油酯、聚甘油脂肪酸酯混合物(B)、水相(C)依此加入油相(A)容器中；
5)在室温条件下，选用定时恒温磁力搅拌器，并以200rpm·min-1的转速磁力搅拌30min，即可得到这种穿膜肽-乙酰基六胜肽纳米乳。
一种穿膜肽-乙酰基六胜肽纳米乳及其制备方法
技术领域
[0001]本发明涉及到人体面部美容、护肤保健及其皮肤抗衰老美容化妆品等相关学科领域，具体涉及一种可用于面部皮肤美容、并可经皮渗透和透皮吸收的穿膜肽携带乙酰基六胜肽(穿膜肽一乙酰基六胜肽)纳米乳及其制备方法。
背景技术
[0002]1、皮肤屏障功能及其透皮吸收的相关技术背景
[0003]人体皮肤(Skin)是覆盖在体表的最大组织器官，它不仅具有保护整个机体、并具有分泌、排泄、感知及代谢等生理功能，而且它也是人体外部最重要的天然屏障，可使机体内各种组织和器官免受外界物理性、化学性、机械性和病原微生物性等物质浸入机体和侵害身体，同时还防止体内的水分、电解质以及其他物质流失体外。事实上，人体皮肤具有的这些生理功能(包括皮肤屏障功能) 与其特殊的组织结构密切相关。因为人体皮肤组织由外向内分为三层，即表皮层、真皮层和皮下组织。最外层的表皮层微观
结构由内向外又可分为基底细胞层、棘细胞层、颗粒层、透明层和角质层(但面部皮肤组织表皮层尚无透明层结构)。人体表皮厚度约为0.070-0.120mm，主要由角朊细胞和树枝状细胞组成。在表皮层，各种功效成分的经皮渗透和透皮吸收主要与角朊细胞的角化过程及其程度有关。皮肤组织中间层的真皮层，则是位于表皮与皮下组织之间的结构组织，与同属于结缔组织的胶原纤维和弹力纤维共同交织为网状纤维。在电镜下，真皮层呈纤维网状结构，胶原纤维与弹力纤维相互交织、纵横交错，中间充满了无定形的基质，并有皮肤附属器及丰富的神经、血管和淋巴管等。皮肤组织最下层的皮下组织位于则真皮之下，是一种含有大量的脂肪细胞的疏松的组织。在皮下组织中有汗腺、血管、淋巴管神经等。通常，皮肤组织中的真皮层中存在丰富的毛细血管，功效成分如渗透到达真皮后可很快被吸收，而吸收透皮功效成分又能很快进入血液循环。而表皮最外层的角质层由于角质化程度高、含水量低并且被脂质的细胞外基质所包裹，是各种功效成分进入皮肤组织内的主要屏障。因此，各种功效成分经皮渗透和透皮吸收的关键因素之一，主要是在于它们如何透过皮肤组织最外层的角质层。 [0004]理论上讲，体外各种功效成分经皮渗透和透皮吸收主要有两种可能的途径： (1)通过表皮途径，透过角质层和表皮各层进入真皮被毛细血管吸收进入体循环，这是功效成分经皮渗透和透皮吸收的主要途径。在这途径中，药物可以穿过角质层细胞到达活性表皮，也可以通过角质层细胞间隙到达活性表皮。由于角质层细胞扩散阻力太，所以功效成分主要由细胞间扩散通过角质层。角质层细胞间是类脂分子形成的多层脂质双分子层，类脂分子的亲水部分结合水分子形成水性区，而类脂分子的烃链部分形成疏水
区，极物分子经角质层细胞间的水性区渗透，而非极物分子经由疏水区渗透。(2)通过毛囊、皮脂腺和汗腺等途径：即功效成分有可能通过人体皮肤组织的附属器，如毛囊、皮脂腺和汗腺等途径经皮渗透和透皮吸收，从而发挥相应的生物学作用和生理学功能。
[0005]从美容功能化妆品的功效作用讲，其美容功能的发挥和获得，与其中功效成分的经皮渗透和透皮吸收有着密切关联，而有关经皮渗透和透皮吸收的作用机制目前主要包括
以下几种假说：第一，通过物理法作用直接破坏皮肤角质层的完整性，使得功效成分通过皮肤上的破损处直接进入角质层以下，如采用离子电渗促透、电穿孔促透、超声波促透、激光促透、微针促透、热灼伤、磨皮等等；第二，通过化学法作用使得皮肤角质层中类脂双分子层的有序排列发生变化，一定程度上增加类脂双分子层的流动性，药物分子得以从角质层疏松间隔中顺利通过，如二甲基亚砜、氮酮类化合物、脂质体、氨基酸及其衍生物、表面活性剂、树枝状大分子、挥发油类薄荷油、桉叶油、松节油等以及一些天然产物等，另外还有萜烯类、生物碱类、内酯类、醇类等也能使得功效成分渗透进入皮肤；第三，通过物理或化学作用提高皮肤表面角蛋白与水的结合能力，改变皮肤角质层的水合作用，而功效成分随着水合作用渗透进入皮肤；第四，通过物理或化学作用影响皮肤附属器官，如促透剂渗入皮脂腺管内溶解皮脂或腺腔壁上皮脂性分化细胞，降低皮脂腺管内的疏水性，促进离子型药物透过皮肤。促透剂通过软化角质层扩大汗腺和毛囊开口，从而有利于功效成分通过皮肤并进一步吸收。而目前所采用的经皮渗透和透皮吸收的相关方法均与其相关。
[0006]经皮传递给药或皮肤外用途径给药虽然遇到人体皮肤天然屏障的技术瓶颈，但它也代表了一种目的药物和功效成分非常有价值的运输通道和渗透途径。经皮传递给药或皮肤外用途径给药相对于其他给药方式更加简单和便捷，也更加安全和方便。同时，这种方式也更少痛苦，还可避免肝脏首过效应，并降低注射针管再利用对疾病传播的风险。尤其是，在医学美容和化妆品领域，加快促进功效成分的经皮渗透和透皮吸收具有重要意义和应用价值。
[0007]2、纳米乳及其应用的相关技术背景
[0008]纳米乳(nanoemulsion，NE)之概念最早起源于上世纪四十年代，由Schulman 和H o a r等首次提出；1959年S c h u l m a n又提出将纳米乳(N E)正式命名为“微乳 (microemulsion，ME)”这一分散体系的概念，由此纳米乳(NE)或称之为微乳(ME) 的命名一直沿用至今。然而它真正在医药学界将其作为经皮途径给药的药物传递载体应用，其实是在1974年由Aitwood博士等学者率先发现、研究、应用和公开报道。上世纪90年代，NE或ME作为透皮给药系统已成为医学和药剂学研究的热点，2000年以后，NE或ME便成为当今国际上医药学界具有巨大应用潜力的研究领域，2006年起便开始在护肤保健及功效美容化妆品领域正式出现。
[0009]NE或ME虽其科学形成机制和透皮作用机理错综复杂，但它们的基础体系组成和构成成分主要是由水相、油相、乳化剂/助乳化剂或者表面活性剂/助表面活性剂等伪三元相液体共同组成，将这伪三元
相液体按照科学设计和实验确定的适当比例关系，便可在常温条件下采用相关仪器和方法配制、而形成热力学稳定的胶体分散体系。通常情况下NE或ME 基础体系的外观清澈透明、微带乳光、且分散性好、流动性佳、液体黏度低、各向同性，其粒径分布均匀、直径范围在10～110nm之间。NE或ME是迄今为止尚无一种NE或ME形成机制能完整和确切地阐述和解释NE或ME体系形成的科学理论，诸如NE或ME体系负界面张力形成机制、混合膜形成理论、几何排列理论和R比理论等都很难非常科学、完整和准确地解释和阐明之，当今同学科领域普遍认为和认同的负界面张力形成机制可谓目前认为较为科学和合理的理论及其解释。这种负界面张力形成理论的核心及其关键点，在于NE或ME在自发和自主形成的动态过程之中，其界面张力机制起着至关重要的作用，即乳化剂或表面活性剂能够引起水包油(O/W) 界面张力的下降，加入适量助乳化剂或助表面活性剂又能促使O/W界
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