(19)中华人民共和国国家知识产权局
(12)发明专利申请
(10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请号 201911397431.5
(22)申请日 2019.12.30
(71)申请人 贵州泛特尔细胞生物技术有限公司
地址 550000 贵州省贵阳市观山湖区金阳
科技产业园
(72)发明人 边曙光 张凤宁 汪国云 曾智芃
明凯
(74)专利代理机构 重庆强大凯创专利代理事务
所(普通合伙) 50217
代理人 刘永来
(51)Int.Cl.
C12N 5/0775(2010.01)
(54)发明名称
(57)摘要
本发明属于生物医药领域，涉及一种获取细
胞分泌蛋白的方法，具体涉及一种获取脂肪干细
胞分泌蛋白的方法。本法从脂肪组织中分离得到
脂肪干细胞，对脂肪干细胞进行原代和传代培
养，然后再对脂肪干细胞进行饥饿培养，从而获
得了大量的脂肪干细胞分泌蛋白。获得的分泌蛋
白具有较高的生物活性，可以应用于对细胞损伤
修复的微环境建立，化妆品，抗衰老，疾病等
诸多领域，
具有广阔的应用前景。权利要求书1页 说明书8页CN 110982785 A 2020.04.10
C N 110982785
A
1.一种获取脂肪干细胞分泌蛋白的方法，其特征在于，包括以下步骤：
S1：获取脂肪干细胞；从脂肪组织中获取基质血管成分，并从基质血管成分中分离得到原代脂肪干细胞，对原代脂肪干细胞进行一次继代培养，获得脂肪干细胞；
S2：脂肪干细胞预培养：将S1中获得的脂肪干细胞接种在无酚红完全培养基中，对脂肪干细胞进行预培养，获得活化脂肪干细胞；
S3：脂肪干细胞饥饿培养：移除活化脂肪干细胞的无酚红完全培养基，并用生理盐水洗涤活化脂肪干细胞，然后使用复方电解质注射液对活化脂肪干细胞进行饥饿培养；饥饿培养结束后收集上清液Ⅰ。
2.根据权利要求1所述的一种获取脂肪干细胞分泌蛋白的方法，其特征在于，在S1中，从脂肪组织中获取基质血管成分的方法如下：将脂肪组织清洗和剪碎，然后在脂肪组织中加入酶溶液，对脂肪组织进行酶解消化处理；酶解消化处理后用脂肪干细胞培养基终止酶解消化，脂肪干细胞培养基的体积为酶溶液的体积的5-10倍；再使用100μm细胞滤网过滤，获得基质血管成分。
3.根据权利要求2所述的一种获取脂肪干细胞分泌蛋白的方法，其特征在于，在S1中，所述酶溶液为Ⅰ型胶原酶溶液或者胰蛋白酶溶液；在Ⅰ型胶原酶溶液中，Ⅰ型胶原酶的浓度为2-3mg/ml；所述胰蛋白酶溶液中，胰蛋白酶的浓度为2-3mg/ml；酶解消化处理的温度为35-40℃，时长为40-80min。
4.根据权利要求3所述的一种获取脂肪干细胞分泌蛋白的方法，其特征在于，在S1中，从基质血管成分中分离得到原代脂肪干细胞的方法为：将基质血管成分接种于含有双抗的脂肪干细胞培养基中，对基质血管成分进行培养；培养完成后，除去未贴壁的细胞，获得贴壁的原代脂肪干细胞；所述双抗在脂肪干细胞培养基中的体积浓度为0.5-1.5％。
5.根据权利要求1所述的一种获取脂肪干细胞分泌蛋白的方法，其特征在于，在S2中，在无酚红完全培养基中加入胭脂花提取物。
6.根据权利要求5所述的一种获取脂肪干细胞分泌蛋白的方法，其特征在于，所述胭脂花提取物由如下方法制备：使用乙醇溶液对胭脂花花蕾浸提，获得提取液，将提取液浓缩干燥获得粗提物；将粗提物分散于水中，过滤去除固相，得粗提物水溶液；然后使用大孔树脂纯化所述粗提物水溶液，获得目的洗脱液，将目的洗脱液浓缩蒸干，获得胭脂花提取物。
7.根据权利要求6所述的一种获取脂肪干细胞分泌蛋白的方法，其特征在于，将胭脂花提取物分散于水中，获得胭脂花提取物溶液，胭脂花提取物溶液的浓度为300-500mg/L。
8.根据权利要求7所述的一种获取脂肪干细胞分泌蛋白的方法，其特征在于，胭脂花提取物溶液和无酚红完全培养基的体积比为1:(20-30)。
9.根据权利要求8所述的一种获取脂肪干细胞分泌蛋白的方法，其特征在于，S3还包括获取上清液Ⅱ的步骤：取S2获得的活化脂肪干细胞，移除无酚红完全培养基后，用生理盐水洗涤活化脂肪干细胞；然后将上清液Ⅰ加入活化脂肪干细胞中，对活化脂肪干细胞进行饥饿培养；饥饿培养结束后收集上清液Ⅱ。
10.根据权利要求9所述的一种获取脂肪干细胞分泌蛋白的方法，其特征在于，S3还包括获取上清液Ⅲ的步骤：取S2获得的活化脂肪干细胞，移除无酚红完全培养基后，用生理盐水洗涤活化脂肪干细胞；然后将上清液Ⅱ加入活化脂肪干细胞中，对活化脂肪干细胞进行饥饿培养；饥饿培养结束后收集上清液Ⅲ。
权 利 要 求 书1/1页CN 110982785 A
一种获取脂肪干细胞分泌蛋白的方法
技术领域
[0001]本发明属于生物医药领域，涉及一种获取细胞分泌蛋白的方法，具体涉及一种获取脂肪干细胞分泌蛋白的方法。
背景技术
[0002]脂肪干细胞(adipose-derived stem cells，ADSCs)能分泌相当数量的细胞因子，包括肝细胞生长因子(HGF)、血管内皮生长因子(VEGF)、胎盘生长因子(PGF)、转化生长因子-β(TGF-β)、成纤维细胞生长因子(FGF-2)等，这些细胞因子有利于建立更好的损伤修复微环境。其中，脂肪干细胞是指从脂肪组织中分离得到的一种具有多向分化潜能的干细胞。脂肪干细胞具有取材方便，而且其分化能力与其他骨髓来源的干细胞相当。脂肪干细胞在再生医学领域发挥着重要作用，可以用于组织器官再造、皮肤再生、脂肪再生等。但是在普通培养的情况下，脂肪干细胞只能产生一定数量的分泌蛋白，需要采集大量脂肪组织用以收集脂肪干细胞，从而获得足够量的分泌蛋白。脂肪组织的采集过程较为复杂，从而影响了脂肪干细胞的分泌蛋白的广泛应用，亟需开发一种能够刺激脂肪干细胞大量表达和分泌具有生物活性的分泌蛋白的方法。
发明内容
[0003]本发明的目的在于提供一种获取脂肪干细胞分泌蛋白的方法，该方法能够提高脂肪干细胞分泌蛋白的表达，并且通过此法可以获得生物活性高、产量高的脂肪干细胞分泌蛋白。
[0004]为解决上述技术问题，本发明技术方案如下：
[0005]一种获取脂肪干细胞分泌蛋白的方法，包括以下步骤：
[0006]S1：获取脂肪干细胞；从脂肪组织中获取基质血管成分，并从基质血管成分中分离得到原代脂肪干细胞，对原代脂肪干细胞进行一次继代培养，获得脂肪干细胞；
[0007]S2：脂肪干细胞预培养：将S1中获得的脂肪干细胞接种在无酚红完全培养基中，对脂肪干细胞进行预培养，获得活化脂肪干细胞；
[0008]S3：脂肪干细胞饥饿培养：移除活化脂肪干细胞的无酚红完全培养基，并用生理盐水洗涤活化脂肪干细胞，然后使用复方电解质注射液对活化脂肪干细胞进行饥饿培养；饥饿培养结束后收集上清液Ⅰ。
[0009]采用上述技术方案，技术原理如下：从脂肪组织中分离获得脂肪干细胞，经过原代培养和一次传代培养，提高脂肪干细胞的数量和纯度。再通过预培养充分激活脂肪干细胞的分泌活性并获得足够量的脂肪干细胞，使得脂肪干细胞为后续的饥饿培养做好数量和生长状态上的准备。最后移除活化脂肪干细胞中的培养基，使用复方电解质注射液对脂肪干细胞进行培养，复方电解质注射液仅维持细胞的渗透压平衡，不能为细胞提供营养物质，在营养缺乏的情况下，细胞产生应急反应，从而刺激活化脂肪干细胞大量表达分泌蛋白，收集的上清液Ⅰ中含有脂肪干细胞表达的分泌蛋白。
[0010]其中，基质血管成分(SVF，Stromal Vascular Fraction)是指是从生物体中抽取的脂肪组织中提取有效成分，含有多种具有修复功能的细胞以及细胞因子混合物形成的细胞。本方案只涉及获得脂肪组
织之后的细胞分离、培养等操作，不涉及取脂肪组织等的外科手术过程。S1中的原代脂肪干细胞为P0代脂肪干细胞，脂肪干细胞为原代脂肪干细胞经一次传代获得的P1代脂肪干细胞。
[0011]有益效果：
[0012](1)通过复方电解质注射液的培养和刺激，脂肪干细胞可以分泌出大量的具有较高生物活性的分泌蛋白，该分泌蛋白可以应用到器官、组织、细胞等的修复中，起到良好的促进作用。现有技术中，使用到了脂肪间充质干细胞的分泌蛋白来生产具有抗炎或组织修复功能的产品。发明人研究发现脂肪干细胞的分泌蛋白比脂肪间充质干细胞的分泌蛋白的生物活性更高，具有更高的应用价值。
[0013](2)从脂肪组织分离出来的原代的脂肪干细胞纯度低，数量有限，不能直接用于诱导分泌蛋白的表达。但是脂肪干细胞在体外培养的条件下会很快发生分化，不能稳定存在，如果将脂肪干细胞多次传代培养，脂肪干细胞会逐步分化，分泌功能降低，从而降低了分泌蛋白的活性。发明人通过大量实验发现，将原代的脂肪干细胞经过一次传代培养可获得细胞活性及细胞纯度较高，满足要求且未发生分化的P1代脂肪干细胞，从而保证了分泌蛋白的活性及数量。
[0014]进一步，在S1中，从脂肪组织中获取基质血管成分的方法如下：将脂肪组织清洗和剪碎，然后在脂肪组织中加入酶溶液，对脂肪组织进行酶解消化处理；酶解消化处理后用脂肪干细胞培养基终止酶解消化，脂肪干细胞培养基的体积为酶溶液的体积的5-10倍；再使用100μm细胞滤网过滤，获得基质血管
成分。
[0015]采用上述技术方案，可将基质血管成分从脂肪组织中充分分离。
[0016]进一步，在S1中，所述酶溶液为Ⅰ型胶原酶溶液或者胰蛋白酶溶液；在Ⅰ型胶原酶溶液中，Ⅰ型胶原酶的浓度为2-3mg/ml；所述胰蛋白酶溶液中，胰蛋白酶的浓度为2-3mg/ml；酶解消化处理的温度为35-40℃，时长为40-80min。
[0017]采用上述技术方案，上述浓度的Ⅰ型胶原酶或者胰蛋白酶可以充分除去脂肪组织中的细胞外基质，使得包括脂肪干细胞在内的基质血管成分分离出来。上述的酶解消化处理温度可以保证Ⅰ型胶原酶或者胰蛋白酶的生物活性，上述的酶解时间可以保证脂肪组织中的细胞外基质被充分降解。
[0018]进一步，从基质血管成分中分离得到原代脂肪干细胞的方法为：将基质血管成分接种于含有双抗的脂肪干细胞培养基中，对基质血管成分进行培养；培养完成后，除去未贴壁的细胞，获得贴壁的原代脂肪干细胞；所述双抗在脂肪干细胞培养基中的体积浓度为0.5-1.5％。
[0019]采用上述技术方案，经含有双抗的脂肪干细胞培养基的培养后，原代脂肪干细胞贴壁生长，其他杂细胞悬浮在培养基中。双抗的使用可以防止原代的脂肪干细胞被细菌污染。双抗是指青霉素和链霉素两种抗生素。
[0020]进一步，在S2中，在无酚红完全培养基中加入胭脂花提取物。
[0021]采用上述技术方案，可以充分活化脂肪干细胞，从而提高后续的饥饿培养中脂肪干细胞的分泌蛋白的产生的量。胭脂花(Mirabilis jalapa L.)为紫茉莉科植物，胭脂花提
取物中含有黄酮、萜类和有机酸等成分，具有抗炎和抗氧化的作用，被广泛应用到化妆品的生产中。发明人将此种成分加入培养基中，用以保护培养基中营养成分，因为在培养过程中营养成分的改变(如氧化变质)，会导致脂肪干细胞提前发生分化，从而降低其分泌蛋白的活性。发明人意外发现，加入胭脂花提取物之后可以大大增加脂肪干细胞的分泌蛋白的产生量，且在后期检测中没有发现胭脂花提取物的残留。发明人分析，产生这种现象的原因在于，胭脂花提取物可以加强蛋白质合成和分泌的信号通路。
[0022]进一步，所述胭脂花提取物由如下方法制备：使用乙醇溶液对胭脂花花蕾浸提，获得提取液，将提取液浓缩干燥获得粗提物；将粗提物分散于水中，过滤去除固相，得粗提物水溶液；然后使用大孔树脂纯化所述粗提物水溶液，获得目的洗脱液，将目的洗脱液浓缩蒸干，获得胭脂花提取物。
[0023]采用上述技术方案，可以制备获得具有刺激脂肪干细胞产生分泌蛋白功能的胭脂花提取物。使用胭脂花花蕾为原料，通过乙醇浸提和大孔树脂纯化可以获得本方案的胭脂花提取物。初步分析显示，胭脂花提取物中含有多糖和黄酮类物质，发明人将针对胭脂花提取物的活性成分和作用机理进行更加深入的研究。
[0024]进一步，将胭脂花提取物分散于水中，获得胭脂花提取物溶液，胭脂花提取物溶液的浓度为300-500mg/L。
[0025]采用上述技术方案，将胭脂花提取物溶解于水有利于将其功效成分充分分散，使得功效成分可以和脂肪干细胞充分结合；灭菌处理保证了培养体系不受到细菌污染。[0026]进一步，胭脂花提取物溶液和无酚红完全培养基的体积比为1:(20-30)。[0027]采用上述技术方案，可以保证胭脂花提取物中的功效成分充分刺激脂肪干细胞产生分泌蛋白，同时也不会对脂肪干细胞产生细胞毒性。
[0028]进一步，S3还包括获取上清液Ⅱ的步骤：取S2获得的活化脂肪干细胞，移除无酚红完全培养基后，用生理盐水洗涤活化脂肪干细胞；然后将上清液Ⅰ加入活化脂肪干细胞中，对活化脂肪干细胞进行饥饿培养；饥饿培养结束后收集上清液Ⅱ。
[0029]采用上述技术方案，使用上清液Ⅰ对新的脂肪干细胞进行培养，可以富集分泌蛋白，从而提高分泌蛋白的浓度以满足应用需求。
[0030]进一步，S3还包括获取上清液Ⅲ的步骤：取S2获得的活化脂肪干细胞，移除无酚红完全培养基后，用生理盐水洗涤活化脂肪干细胞；然后将上清液Ⅱ加入活化脂肪干细胞中，对活化脂肪干细胞进行饥饿培养；饥饿培养结束后收集上清液Ⅲ。
[0031]采用上述技术方案，使用上清液Ⅱ对新的脂肪干细胞进行培养，可以富集分泌蛋白，从而提高分泌蛋白的浓度以满足应用需求。
具体实施方式
[0032]下面通过具体实施方式进一步详细说明：
[0033]实施例1：获取脂肪干细胞分泌蛋白的实例
[0034]S1：获取脂肪干细胞：
[0035](1)脂肪组织处理：使用生理盐水清洗采集的脂肪组织，将血渍冲洗干净，生理盐水中加入了双抗，双抗在生理盐水中的体积浓度为1％。双抗是指含有青霉素和链霉素的溶液，其中，青霉素100UI/ml，链霉素50UI/ml。将脂肪组织装入离心管后用尖头剪刀剪碎至1-
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