(19)中华人民共和国国家知识产权局
(12)发明专利申请
(10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请号 202210054940.3
(22)申请日 2022.01.18
(71)申请人 华南理工大学
地址 510640 广东省广州市天河区五山路
381号
(72)发明人 潘力 廖清 王斌
(74)专利代理机构 广州市华学知识产权代理有
限公司 44245
代理人 崔红丽
(51)Int.Cl.
C12N 9/22(2006.01)
C12N 15/70(2006.01)
C07K 19/00(2006.01)
C12N 15/87(2006.01)
C12R 1/19(2006.01)
C12R 1/685(2006.01) (54)发明名称
用
(57)摘要
本发明公开一种高效表达及纯化Cas9蛋白
的方法和应用。本发明主要包括Cas9表达载体的
构建，大肠杆菌的转化，Cas9蛋白的诱导表达，
Cas9蛋白的纯化，以及体内体外的应用。使用GB1
作为促溶标签，可增加SpCas9的稳定性及溶解
性，初步提高SpCas9的表达量，且GB1不影响
SpCas9的功能，后续不需去除，简便可行。再通过
使用10×His标记，有助于融合蛋白与Ni ‑NTA树
脂的高亲和力，并有助于高盐洗去除污染的核
酸，提高纯化效果。使用串联T7启动子，明显提高
SpCas9的表达量。通过体内外应用，证明了所纯
化得到的SpCas9‑GB1蛋白正确折叠，具有切割
DNA的能力，
且可入核进行基因编辑。权利要求书1页 说明书8页序列表8页 附图5页CN 114410608 A 2022.04.29 C N 114410608
A
1.一种高效表达及纯化Cas9蛋白的方法，其特征在于：包括以下步骤：
步骤1，构建多重启动子驱动的核酸酶Cas9表达载体pet28a+‑SpCas9‑GB1‑10×His ‑3T7；
步骤2，Cas9表达载体pet28a+‑SpCas9‑GB1‑10×His ‑3T7的表达：将构建的pet28a+‑SpCas9‑GB1‑3T7转入宿主E.coli Rosetta(DE3)，获得重组菌株；将重组菌株转接活化，利用IPTG进行诱导表达，离心收集菌体，获得表达SpCas9‑GB1蛋白的菌体；
步骤3，SpCas9‑GB1蛋白的纯化：用缓冲液将步骤2的菌体重悬，超声破碎，离心收集上清，得到阳性克隆中可溶性SpCas9‑GB1蛋白，过滤除去细胞碎片及颗粒后，直接将过滤后液体上样经Ni+亲和层析柱纯化，收集洗脱的蛋白，得到SpCas9‑GB1蛋白溶液；将得到的SpCas9‑GB1蛋白溶液超滤浓缩，即得SpCas9‑GB1蛋白。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：
还包括步骤4：步骤4，SpCas9‑GB1蛋白的应用：将SpCas9‑GB1与sgRNA进行组装后用于体外切割模板及转入真菌宿主内进行基因编辑，确定SpCas9‑GB1是否正确折叠具有切割DNA和入核进行基因编辑的能力。
3.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于：
所述的SpCas9‑GB1‑10×His的序列如SEQ ID NO：19所示。
4.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于：
步骤2中的重组菌株挑取于Kan+及CHL+的LB液体培养基中，37±1℃，200～220rpm培养8～16h活化；活化后按照(1～5)：100的转接比例量取活化菌液于Kan+及CHL+的LB液体培养基，37±1℃、200～220rpm培养至OD 600为0.6～0.8时，加入IPTG至终浓度为0.3～0.8mM进行诱导表达。
5.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于：
步骤2中诱导表达的条件为16～20℃，200～220rpm；发酵时间为18～22h。
6.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于：
步骤2中所述的离心的条件为4～8℃，8000～10000rpm离心5～10分钟。
7.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于：
步骤3中超声破碎的条件为：超声开3s，超声关3s，功率为30～40％，冰上超声20～30min。
8.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于：
步骤3中所述的离心的条件为4～8℃，8000～10000rpm离心30～40min。
9.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于：
步骤3中，SpCas9‑GB1蛋白的洗脱采用梯度洗脱，使用Buffer A的咪唑浓度为0mM，Buffer B的咪唑浓度500mM；梯度为5％、10％、20％、30％、50％Buffer B；
Buffer A：500mM NaCl，20mM Tris ‑HCl，PH＝8.0；
Buffer B：500mM NaCl，500mM Imidazole，20mM Tris ‑HCl，PH＝8.0。
10.权利要求1～9任一项所述的高效表达及纯化Cas9蛋白的方法在高效表达及纯化Cas9蛋白中的应用。
权 利 要 求 书1/1页CN 114410608 A
一种高效表达及纯化Cas9蛋白的方法和应用
技术领域
[0001]本发明属于生物技术和基因工程技术领域，涉及一种多重启动子驱动的核酸酶Cas9‑GB1蛋白表达载体及蛋白表达纯化方法，具体涉及一种高效表达及纯化Cas9蛋白的方法和应用。
背景技术
[0002]来源于原核生物的聚簇规律间隔短回文重复序列(CRISPR)相关RNA引导的Cas9内切酶活性的应用使得在多个物种中进行基因编辑变得简单、快速。在CRISPR系统中主要包括Cas9蛋白和单链导RNA(single guide RNA，sgRNA)两个部分。Cas9蛋白是核酸酶，含有两个具有切割活性的结构域：HNH结构域和RuvC结构域，可以在gRNA存在时将其引导于特定的位置对靶位点进行切割，造成DNA双链断裂。目前CRISPR系统已经应用于多钟物种的基因编辑。
[0003]体外组装Cas9蛋白和sgRNA所形成的核糖蛋白复合物(RNP)也具有基因编辑的能力，目前也已经应用于多种生物中进行基因编辑。RNP的基因编辑具有多种优点：如RNP避免了在宿主体内进行翻译表达，易于降解，对宿主基因组进行瞬时切割，可以减少脱靶效应；只需更换sgRNA，就可以靶向不同的位点，省去了构建质粒的繁琐的过程，方便进行通量的基因编辑；同时，RNP也可以用于体外切割模板，验证sgRNA的效率。
[0004]目前，Cas9蛋白在表达纯化过程中，易出现形成包涵体形式的不溶解性蛋白，内毒素含量高、蛋白过大导致蛋白折叠不正确、产量低等问题，此外，目前市场上Cas9蛋白价格昂贵，这也限制了Cas9系统在生物体外组装，体内编辑的普及性。
发明内容
[0005]为了克服现有技术的缺点与不足，本发明的目的在于提供一种一种高效表达及纯化Cas9蛋白的方法。该方法是一种可以进行基因编辑、体外切割的表达量显著提高的Cas9蛋白表达纯化方法。本发明主要包括Cas9表达载体的构建，大肠杆菌的转化，Cas9蛋白的诱导表达，Cas9蛋白的纯化，以及体内体外的应用。构建的pet28a+‑SpCas9‑GB1‑10×His‑3T7载体中，使用GB1作为促溶标签，可以增加SpCas9的稳定性及溶解性，初步提高SpCas9的表达量，且GB1不影响SpCas9的功能，因此在后续也不需要额外去除，简便可行。再通过使用10×His标记，有助于融合蛋白与Ni‑NTA树脂的高亲和力，并有助于高盐洗去除污染的核酸，提高纯化效果。使用串联T7启动子的方法，明显提高SpCas9的表达量。通过体内外应用，证明了所纯化得到的SpCas9‑GB1蛋白正确折叠，具有切割DNA的能力，且可以入核进行基因编辑。
[0006]本发明的目的通过下述技术方案实现：
[0007]一种高效表达及纯化Cas9蛋白的方法，包括以下步骤：
[0008]步骤1，构建多重启动子驱动的核酸酶Cas9表达载体pet28a+‑SpCas9‑GB1‑10×His‑3T7；
[0009]步骤2，Cas9表达载体pet28a+‑SpCas9‑GB1‑10×His‑3T7的表达：将构建的pet28a +‑SpCas9‑GB1‑3T7转入宿主E.coli Rosetta(DE3)，获得重组菌株；将重组菌株转接活化，利用IPTG进行诱导表达，离心收集菌体，获得表达SpCas9‑GB1蛋白的菌体；
[0010]步骤3，SpCas9‑GB1蛋白的纯化：用缓冲液将步骤2的菌体重悬，超声破碎，离心收集上清，得到阳性克隆中可溶性SpCas9‑GB1蛋白，过滤除去细胞碎片及颗粒后，直接将过滤后液体上样经Ni+亲和层析柱纯化，收集洗脱的蛋白，得到SpCas9‑GB1蛋白溶液；将得到的SpCas9‑GB1蛋白溶液超滤浓缩，即得SpCas9‑GB1蛋白。
[0011]为了更好的实现本发明，还包括步骤4：
[0012]步骤4，SpCas9‑GB1蛋白的应用：将SpCas9‑GB1与sgRNA进行组装后用于体外切割模板及转入真菌宿主内进行基因编辑，确定SpCas9‑GB1是否正确折叠具有切割DNA和入核进行基因编辑的能力。
[0013]进一步地，步骤1中的载体构建：将pet28a+质粒上的6×硫氧还原蛋白‑组氨酸标签替代为10×硫氧还原蛋白‑组氨酸标签，T7启动子数量增加为3重，同时将链球菌蛋白G (Streptococcal protein G，GB1)的56‑残基B1免疫球蛋白结合域用作融合标签通过linker(ggtggagcaggtggcagtggcgcagggggagccgga)与C
as9蛋白连接，将密码子优化的，易于在大肠杆菌中表达的的整个Cas9‑GB1的基因序列与pet28a+的10×硫氧还原蛋白‑组氨酸标签相连。所述的优化将原有GB1序列中稀有密码子及不易于蛋白翻译的碱基替换为易于在宿主菌中翻译表达的碱基。
[0014]更进一步的，所述的SpCas9‑GB1‑10×His的序列如SEQ ID NO：19所示。
[0015]进一步地，步骤2中的重组菌株挑取于Kan+及CHL+的LB液体培养基中，37±1℃，200～220rpm培养8～16h活化(优选的，37±1℃，220rpm培养16h活化)；活化后按照(1～5)：100的转接比例量取活化菌液于Kan+及CHL+的LB液体培养基，37±1℃、200～220rpm培养至为0.6～0.8时，加入IPTG至终浓度为0.3～0.8mM(优选为0.5mM)进行诱导表达。
OD
600
[0016]进一步地，步骤2中诱导表达的条件为16～20℃，200～220rpm；发酵时间为18～22h。
[0017]进一步地，步骤2中所述的离心的条件为4～8℃，8000～10000rpm离心5～10分钟；更进一步为4℃，8000rpm离心5分钟。
[0018]进一步地，步骤3中超声破碎的条件为：超声开3s，超声关3s，功率为30～40％(优选为30％)，冰上超声20～30min(优选为20min)。
[0019]进一步地，步骤3中所述的离心的条件为4～8℃，8000～10000rpm离心30～40min；更进一步为4℃，10000rpm离心30min。
[0020]进一步地，步骤3中，SpCas9‑GB1蛋白的洗脱采用梯度洗脱，使用Buffer A(500mM NaCl，20mM Tris‑HCl，PH＝8.0)的咪唑浓度为0mM，Buffer B(500mM NaCl，500mM Imidazole，20mM Tris‑HCl，PH＝8.0)的咪唑浓度500mM。梯度为5％、10％、20％、30％、50％Buffer B。
[0021]进一步地，步骤4中，所用的sgRNA均为T7体外转录得到的。体外切割模板为米曲霉的Niad位点，体内进行基因编辑的为黑曲霉的pyrg位点。所用的Buffer为市售Cas9蛋白配套Buffer。
[0022]上述高效表达及纯化Cas9蛋白的方法在高效表达及纯化Cas9蛋白中的应用。
[0023]本发明相对于现有技术具有如下的优点及效果：
[0024](1)本发明利用GB1作为促溶标签和10×His标签融合表达SpCas9，提高了SpCas9的稳定性，避免了核酸污染，提高纯化效果。采用Ni2+亲和层析柱纯化，可以有效获得高纯度SpCas9‑GB1蛋白，所获得的SpCas9‑GB1蛋白折叠正确。且GB1对于SpCas9功能无影响，后续不需要去除，十分便利。
[0025](2)本发明利用串联T7启动子，在三重T7启动子的情况下，进一步增加了SpCas9‑GB1蛋白的表达量。
[0026](3)本发明通过对纯化获得的SpCas9‑GB1蛋白的体内外应用，验证了纯化后的Cas9‑GB1与sgRNA所形成的复合体可以有效切割体外DNA片段，以及体内的靶向基因。本发明中涉及的SpCas9‑GB1蛋白易于纯化，且纯化度高，切割活性高，可以用于工业生产Cas9蛋白以及实验室Cas9蛋白来源。
[0027](4)本发明在Cas9蛋白的C端融合了NLS核定位信号肽。NLS核定位信号肽可以使得此蛋白不仅可以用于体外切割和原核生物的基因编辑，还适用于真核生物的基因组编辑。
附图说明
[0028]图1是pet28a+质粒的酶切结果琼脂糖凝胶电泳图。
[0029]图2是pet28a+多重启动子载体测序结果图。
[0030]图3是SpCas9、SpCas9‑N、SpCas9‑C、GB1‑C、GB1‑N的PCR结果琼脂糖凝胶电泳图(A、B)及pet28a+质粒的酶切结果琼脂糖凝胶电泳图(B)。
[0031]图4是pet28a+‑2T7质粒使用NcoⅠ和XhoⅠ双酶切的琼脂糖凝胶电泳图。
[0032]图5是pet28a+‑SpCas9‑GB1‑10×His‑3T7质粒图谱。
[0033]图6是SDS‑PAGE分析GB1对于SpCas9表达的影响；其中，His‑SpCas9指SpCas9；NGB1‑SpCas9指GB1‑SpCas9；SpCas9‑CGB1指SpCas9‑GB1。
[0034]图7是SDS‑PAGE分析多重启动子对于SpCas9表达量的影响；其中，A为多重启动子对NGB1‑SpCas9(即GB1‑SpCas9)表达量的影响；B为多重启动子对SpCas9‑CGB1(即SpCas9‑GB1)表达量的影响。
[0035]图8是AKTA pure Ni‑NTA柱纯化后SpCas9‑GB1蛋白的SDS‑PAGE分析胶图。[0036]图9是sgRNA转录模板PCR的琼脂糖电泳胶图。
[0037]图10为纯化后的SpCas9‑GB1蛋白的应用实例图；其中，Cas9‑GB1指SpCas9‑GB1。[0038]图11是纯化后的SpCas9‑GB1蛋白的体内编辑应用实例图；其中，A为阳性、阴性对照板，其中阳性板为未加RNP复合物，且未加筛选物质(5‑氟乳清酸和尿嘧啶核苷)；阴性板为未加RNP复合物，施加筛选物质；B为转化板，转化板为添加RNP复合物，且施加筛选物质。[0039]图12是纯化后的SpCas9‑GB1蛋白基因编辑示意(A)及结果图(B)。
具体实施方式
[0040]下面结合实施例及附图对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。
[0041]下列实施例中未注明具体实验条件的试验方法，通常按照常规实验条件或按照制造厂所建议的实验条件。所使用的材料、试剂等，如无特殊说明，为从商业途径得到的试剂
豫公网安备41160202000603
站长QQ:729038198
关于我们
投诉建议