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Univ. Chem. 2020, 35 (12), 118–126
收稿：2020-10-28；录用：2020-11-09；网络发表：2020-11-13
*通讯作者，Email:*************
基金资助：国家自然科学基金重点项目(NSFC31930016)；北京市科委生物医学前沿创新推进项目(Z181100001318009)
•今日化学• doi: 10.3866/PKU.DXHX202010077 www.dxhx.pku.edu 浅谈2020年诺贝尔化学奖：通向未来的基因编辑 牛煦然，周卓，魏文胜*
北京大学生命科学学院，北京大学生物医学前沿创新中心，北京未来基因诊断高精尖创新中心，北京大
学-清华大学生命科学联合中心，蛋白质与植物基因研究国家重点实验室，北京 100871
摘要：2020年诺贝尔化学奖授予了Jennifer Doudna 和Emmanuelle Charpentier 这两位女科学家，以表彰她们在CRISPR 技术发明上所做出的重要贡献。CRISPR 系统通过向导RNA 和核酸酶Cas 蛋白在基因组上特定位点进行序列编辑，有着高效、精准和可设计等特点，已经被广泛应用于基础生物学研究、基因和动植物育种等诸多领域，并引起了现代生物学领域的巨大技术变革。本文从基因编辑与CRISPR 技术的发现和发展入手，对该技术和它相关的科学故事进行简要总结和评论。 关键词：诺贝尔化学奖；CRISPR ；基因编辑
中图分类号：G64；O6
A Brief Introduction to Nobel Prize in Chemistry 2020: Gene Editing for the Future
Xuran Niu, Zhuo Zhou, Wensheng Wei *
Biomedical Pioneering Innovation Center, Beijing Advanced Innovation Center for Genomics, Peking-Tsinghua Center for Life Sciences, School of Life Sciences, Peking University, Beijing 100871, P. R. China.
包仁
Abstract: The 2020 Nobel Prize in chemistry was awarded to two female scientists, Jennifer Doudna and Emmanuelle Charpentier, to recognize their seminal contribution to the invention of CRISPR technology for genome editing. CRISPR system enables new generation of gene editing through RNA-based recognition of double-stranded DNA. Empowered by its high efficiency, accuracy and programmability, CRISPR technology has revolutionized modern biology, and has been widely applied in basic research, gene therapy, animal and plant breeding. Here, we briefly introduce the discovery of CRISPR system and the scientific stories behind, and discuss the on-going development and future directions of many gene-editing related technologies.
Key Words: Nobel Prize in chemistry; CRISPR; Gene editing
2020年10月7日下午5点48分，备受瞩目的诺贝尔自然科学奖的压轴项目——化学奖揭晓了。瑞典皇家科学院常任秘书Goran K. Hansson 宣布，2020年诺贝尔化学奖授予美国加州大学伯克利分校的Jennifer Doudna 和现在德国柏林马克斯∙普朗克病原学研究室工作的法国科学家Emmanuelle Charpentier (图1)，用以表彰她们开发了一种新的基因组编辑方法：CRISPR/Cas9 (Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats/CRISPR-associated protein 9)。自2012年这项振奋人心的技术正式诞生到它的发明人摘得诺贝尔奖桂冠，只用了8年时间，反映出这项工作的
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巨大意义与价值。我们希望用此文简要回顾CRISPR技术的发明和发展应用，试图说明该技术为何在短时间内掀起了科学界的巨大变革，并深刻影响了现代生物科技与人类生活。
图1 获得2020年诺贝尔化学奖的两位科学家
图源自两位科学家实验室个人主页
1 基因与基因编辑
1.1 与基因相关的几个重要科学问题
长久以来，人们一直在试图通过各种努力回答这样几个问题：基因是什么？我们能否读懂生命的密码进而改写基因？如果可以对基因进行编辑，能为人类生命健康带来什么好处？
伴随着萨顿、摩尔根、艾弗里、沃森和克里克等一系列先驱人物的探索与发现，我们已经知道基因是具有遗传效应的DNA片段，而它的真正奥秘就蕴含在A (腺嘌呤)、G (鸟嘌呤)、C (胞嘧啶)和T (胸腺嘧啶)这四种碱基的排列组合中。随着桑格测序法的诞生，读出基因序列已经不是难题；在组学与生物信息学迅速发展的近20年来，读懂、注释并整理遗传信息的含义已经成为成熟的技术体系。然而，真正实现对于生物本身基因的“编辑”，一直是多年来生物学家孜孜以求的目标。1.2 基因编辑与它的原理
近10年来，随着人工核酸酶技术的发展，对于基因的改造已经突破了基因重组及基因在个体/物种间转移，迈入了使用一把分子剪刀对基因进行高效且精准编辑的时代。
除了CRISPR/Cas系统之外，还有大范围核酸酶技术(meganuclease) [1]，锌指核酸酶技术(zinc finger nuclease, ZFN) [2]和转录激活因子样效应物核酸酶技术(transcription activator-like effector nuclease, TALEN) [3]。这些人工核酸内切酶能够在基因组上精确诱导DNA发生双链断裂。因为DNA 是一个双链结构，两条链的同时断裂意味着将这条储存着遗传信息的染体一分为二，细胞必须迅速对其进行修复。多数时候，细胞通过非同源末端连接的方式将断裂的DNA重新连接起来，在这一修复过程中，重新连接的位置往往出现不同长度DNA片段的插入或删除，因而产生移码突变导致基因表达出错和功能失活。如果此时细胞中存在与断裂位点附近序列同源的DNA模板，细胞有机会利用同源重组的方式进行修复，从而实现对基因组上特定位点的精确插入、删除或者碱基替换[4]。这就像对一本书进行编辑，我们既可以成段删除文字，加入新内容，也可以纠正一两个错别字或者添加标点符号。而生物学
家想要操纵的就是人类基因组这本大书，通过基因组编辑(genome editing)技术实现对生命密码的精准修改或调控。
2 CRISPR的前世今生
2.1 原核生物给我们的启迪
如上文所述，在CRISPR技术诞生之前，基于ZFN、TALEN等核酸酶系统的基因编辑技术已经相继登场并在基础研究和临床医学之间搭起了桥梁。这两种技术的出现无一例外都是科学家从自然界已有的生物系统中获得的启发。ZFN技术中的核心元件——锌指蛋白是科学家从非洲爪蟾的转录
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因子中发现[5]，而TALEN技术中所用到的识别和结合基因组的元件最早来自于植物病原体黄单胞菌属中发现的一种avrBs3蛋白[6]，后来被命名为转录激活因子样效应物[7]：TALE。这两种技术都启示我们，在大自然中蕴藏着无数的生命奥秘，对这些自然奥秘的探究还将继续催生出无数造福人类的新技术。
CRISPR的历史也与原核生物机制研究密不可分。时光倒流到1987年，日本大阪大学的Yoshizumi Ishino (石野良纯)等人很偶然地在大肠杆菌的基因组上发现，在一个名为iap的基因序列中存在长度为2
9个碱基对(bp)的高度重复同源序列，且这些重复序列被长度为32-bp的序列间隔开[8]。当时Yoshizumi Ishino和他的同事们并不知道这一现象的原理和生物学意义，因此在论文中给科学界留下了一个悬念。两年之后，在西班牙阿里坎特大学读博士的年轻学生Fransisco J. M. Mojica在对地中海嗜盐菌进行研究时，在其基因组上同样发现了类似的重复序列[9]。之后几年，Mojica相继在沃氏嗜盐富饶菌[10]、结核分枝杆菌、艰难梭菌及鼠疫杆菌等20余种不同的微生物类中发现了这一特征，并将这一重复序列命名为Short Regularly Spaced Repeats (SRSRs) [11]。
2002年，荷兰乌得勒支大学的Ruud Jansen课题组利用生物信息学分析工具对一系列古菌和细菌的重复序列进行了鉴定，并与Mojica一同为这类重复序列起了新名字：Clustered Regularly Interspaced Palindromic Repeats，也就是我们现在所熟知的CRISPR [12]。经过众多科学家的持续研究(表1)，我们终于知道CRISPR本质上是一种原核生物抵御外界病毒入侵的免疫系统。聪明的原核生物将外界入侵的病毒(如噬菌体)核酸序列留下一部分片段插入到自己的基因组，作为终生“记忆”的蓝本；而Cas (CRISPR-associated proteins)核酸酶，即是原核生物在病毒再次入侵后切割病毒核酸的工具剪刀(图2)。原核生物用这种方法保护了自己，也给科学家打开了探索基因编辑技术的新思路。
表1 CRISPR/Cas诞生发展史大事记
年份科学家内容
1987 Yoshizumi Ishino 首次在大肠杆菌中观察到特殊的重复序列[8]
1993 Fransisco J. M. Mojica 在地中海嗜盐菌中观察到特殊的重复序列[9[
1995 Fransisco J. M. Mojica 在沃氏嗜盐富饶菌嗜盐古菌中观察到类似重复序列[10]
2000 Fransisco J. M. Mojica 在结核分枝杆菌等20余种微生物中发现类似序列，并命名为SRSRs [11]
2002 Ruud Jansen 首次将这个重复序列命名为CRISPR，并鉴定了嗜热链球菌与酿脓链球菌的cas1-4基因[12] 2005 Fransisco J. M. Mojica 在In Silico层面发现了CRISPR与噬菌体的关系[13]
2007 Philippe Horvath 首次通过实验证明原核生物中CRISPR/Cas系统的免疫机制[14]
2008 John vander Oost 首次通过程序设计基于CRISPR的免疫机制的实验[15]
2008 Luciano Marraffini 证明CRISPR的靶标是DNA [16]
迭代2010 Sylvain Moineau 发现嗜热链球菌中的CRISPR/Cas9系统是由crRNAs指引并且在DNA中造成双链断裂[17] 2011 Emmanuelle Charpentier 发现tracrRNA [18]
2011 Virginijus Siksnys 首次在远缘细菌物种中重建CRISPR，并证明Cas9的重要性[19]
2012 Doudna与Charpentier 首次利用CRISPR/Cas系统在体外对DNA进行切割[20]吴川市第二中学
2012 Virginijus Siksnys 利用CRIPSR/Cas系统在体外对DNA进行切割[21]
2013 Feng Zhang 首次利用CRISPR/Cas系统实现对人类细胞进行基因组编辑[22]
帅府家风2013 George M. Church 首次利用CRISPR/Cas系统实现对人类细胞进行基因组编辑[23]
2013 Jennifer A. Doudna 利用CRISPR/Cas系统实现对人类细胞进行基因组编辑[24]
2011年8月，立陶宛维尔纽斯大学的Virginijus Siksnys在Nucleic Acids Research杂志上发表了首次在远缘细菌物种内重建CRISPR的研究论文。在这项研究中，Siksnys课题组将嗜热链球菌的整
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个CRISPR基因位点转入到大肠杆菌内，发现这种重建的CRISPR系统仍然可以实现对质粒和噬菌体DNA的靶向干扰。在这项工作中，Siksnys还证明了Cas9是原核生物进行外源DNA干扰活动唯一必需的蛋白，而它的RuvC和HNH核酸酶结构域对其活性不可或缺[19]。
图2 CRISPR/Cas9源于细菌的免疫系统
图片来源于/prizes/chemistry/2020/press-release/
2.2 CRISPR的诞生
<20年来，前人积累的知识让工具化的CRISPR/Cas系统呼之欲出。从表1中可以看出，截止到2011年，我们现如今所需的CRISPR/Cas9系统的三个必要元件：crRNA、tracrRNA和Cas9已经全部被发现，它们各自的重要功能也得到证实。CRISPR/Cas系统的诞生，只差把这三样重要元件组合在一起并使其发挥基因编辑的功能。
2012年8月，加州大学伯克利分校的Doudna与当时还在瑞典Umeå大学工作的法国科学家Charpentier两个团队合作在Science上发表了一篇利用CRISPR/Cas9系统在体外对DNA进行精确切割的论文[20]。他们在文章中所使用的(也是目前为止应用最广泛的)是一种来源于酿脓链球菌(Streptococcus pyogenes)的Cas9 (SpCas9)蛋白。在这篇文章中，她们还将天然介导Cas9进行DNA切割的引导RNA：crRNA与tracrRNA合并成一条单链RNA——这也是目前广泛应用的sgRNA。至此，CRISPR作为一项在概念上被证明的基因编辑技术正式诞生了。
安徽新长江投资集团122大学化学V ol. 35
需要指出的是，Siksnys课题组几乎同时发现并报道了类似结果。他们利用在大肠杆菌里建立的异源表达系统，使用链酶亲和素标记物标记Cas9来纯化嗜热链球菌的Cas9-crRNA复合体，并在试管内同样观察到了复合物对DNA的切割。同时他们还对Cas9的RuvC结构域以及HNH结构域结合的DNA链进行了研究[21]。很遗憾，Siksnys于2012年4月6日向Cell杂志提交的论文被拒稿，这篇工作最终于2012年9月发表在PNAS。通过这项工作，Siksnys同样清楚地表明：“这些发现为构造普遍可设计的RNA引导的DNA核酸内切酶铺平了道路。”
2013年的1月3日，两篇Science论文登上了历史舞台。一项工作来自MIT Broad研究所的张锋团队，第一次实现了CRISPR系统在人源细胞系中的基因组编辑[22]。另一项工作来自于哈佛大学医学院的George M. Church团队。Church团队将crRNA-tracrRNA的结合物命名为gRNA (guide RNA)，并对人的诱导多能干细胞进行了编辑[23]。随后的1月29日，Doudna团队在eLife杂志报道了使用spCas9系统对人源细胞系进行基因组编辑的研究成果[24]。上述工作的完成，标志着CRISPR/Cas技术真正成为了一项可以在真核细胞中操作的基因编辑工具(图3)。这个新系统利用小巧精短的RNA (长度通常为20-nt)介导序列定位，避免了ZFN和TALEN系统蛋白组装困扰。同时该系统根据目标DNA序列直接设计向导RNA，极大降低了基因编辑的操作门槛。短时间内，这项新技术火遍了全球，成为生物学家的“宠儿”。
图3 CRISPR/Cas9技术原理
图片来源于/prizes/chemistry/2020/press-release/
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