生物物理学报第二十五卷第五期二 九年十月
ACTA BIOPHYSICA SINICA Vol.25 No.5 Oct. 2009
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——2009 年诺贝尔化学奖简述
三氯化钒张凯1，张茨2，孙飞1
(1.中国科学院生物物理研究所生物大分子国家重点实验室，北京100101； 2.中国农业大学生物学院，北京100193)
摘要：作为将基因信息翻译为蛋白质的机器，核糖体对于生命活动至关重要。2009年诺贝尔化学奖授予了在核糖体结构功能研究中做出突出贡献的三位科学家：Venkatram an R am akrishnan（英国剑桥MR C分子生物学实验室），Thom as A.Steitz（耶鲁大学）和Ada E.Yonath（以列魏茨曼科学研究所）。文章以时间为主线，对核糖体结构以及基于结构的功能研究的历程、意义、历史性突破和应用进行了介绍，并由此对结构生物学的未来进行了一些思考。 关键词：核糖体；诺贝尔化学奖；晶体结构
0 引言
2009年诺贝尔化学奖授予了在核糖体结构功能研究中做出突出贡献的三位科学家，他们分别是：英国剑桥MRC分子生物学实验室结构研究部教授Venka tram an Ra ma krishnan，耶鲁大学分子生物物理学和生物化学教授Thomas A.Ste itz，以列魏茨曼科学研究所的结构生物学教授Ada E. Yona th。核糖体对于生命活动至关重要，它就像一架机器，不断地将生命的基因信息“翻译”成蛋白质—
——生物功能的主要执行者；同时，作为非常重要的分子机器，核糖体能够与多种抗生素结合，是开发新的特效抗生素的主要靶标。这三位科学家利用X射线晶体学方法在原子水平上解析了核糖体的三维结构，并对蛋白翻译各个阶段的机理做了深入的研究。他们的研究使得人们对核糖体最基本的工作模式有了清晰的认识，其中，许多成果可被直接应用于实践—
——人们可以借此设计特定的抗生素来妨碍细菌核糖体的正常功能，抑制细菌的生长从而达到治愈疾病的目的。本文对核糖体的基本生物学功能、结构以及对其结构功能研究的历史进行了介绍，以期读者能够对今年的诺贝尔化学奖有一深入的了解。1 核糖体是将基因信息翻译为蛋白质的复杂分子机器
蛋白质是生命活动中非常重要的生物大分子，是生物功能的主要执行者，而核糖体正是用于合成蛋白质的分子机器，它能够严格按照三联体密码子
表将mRNA携带的基因信息准确无误地翻译成蛋白质多肽链—
——转录后的mRNA从细胞核核膜孔被转运出来后，核糖体在各种蛋白因子辅助下附着于mRNA上并开始滑动，将特定氨基酸顺序加入到新生成的多肽链上，从而实现蛋白质的合成。
核糖体作为生命体将基因信息翻译成蛋白质的重要场所，其结构组成既复杂而又极其精密。从外形上看，核糖体的结构像一个扁球形的颗粒，大小为15～20nm，由大小两个亚基组成，分散于细胞质中，或附着在核外膜与内质网上，或存在于线粒体、叶绿体中。原核生物核糖体沉降系数为70S
收稿日期：2009-10-20
基金项目：科技部973“蛋白质机器与机制”(2006B C806506)，蛋白质研究计划“膜蛋白和蛋白质复合体功能与结构研究” (2006C B911001)
通讯作者：孙飞，电话/传真：(010)64888582
E-m ail：feisun@ib p.ac
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（小亚基30S，大亚基50S），分子量约2.5×106道尔顿；大亚基由23S RNA（约2900个核苷酸），5S RNA（约120个核苷酸）和31～35种蛋白质构成；小亚基由16S RNA（约1540个核苷酸）和20～21种蛋白质构成[1,2]。真核生物核糖体沉降系数为80S（小亚基40S，大亚基60S），其分子量约为4×106道尔顿；其大亚基由28S RNA（约4700 个核苷酸）、5S RNA（约120核苷酸）、 5.8S RNA（约160核苷酸）以及约45～50种蛋白构成；其小亚基则由18S rRNA（约1900个核苷酸）和约30种蛋白构成[2,3]。真核细胞器线粒体和叶绿体中的核糖体则和原核生物的非常类似，大小为70S，由30S小亚基和50S大亚基组成，但也有一些细胞器核糖体只有约60S大小。
尽管真核、原核和细胞器中的核糖体在大小组成上有较大差别，但它们的核心结构都是类似的[4]。完整的70S核糖体具有不对称的结构，从轮廓上看，大亚基像一个圆屋顶，而小亚基像一个帽子，更精细一点的电镜结果则表明它是多孔渗水的结构（图1A）。在反应中心附近并没有蛋白质成分，这也说明了核糖体翻译蛋白质完全由RNA催化进行。大小亚基上的蛋白插入各自的RNA中起到固定和支持的作用。在小亚基的头部和中部与大亚基结合形成了V形的隧道，这是蛋白翻译时m RNA通过核糖体的通道。核糖体合成多肽有三个重要的位点（图1B和C），分别为：A位（结合新进入的氨酰tRNA以及形成肽键），P位（结合新合成的肽酰tRNA）和E位（水解后的tRNA 退到此处并由此处离开核糖体）[5]。
2 核糖体三维结构研究的复杂性和困难性
结构生物学常用的三大手段为：X射线晶体学，电子显微学和核磁共振谱学。电子显微学方法的方法获得核糖体内蛋白或核酸的二级结构是不可能的，更不用说原子结构了。核磁共振方法虽然能达到原子分辨率，但它最大的缺陷是只能研究小分子量的蛋白，分子量超过2×104道尔顿，其研究难度急剧增大，对于核糖体这样的超大复合体（2.5×
一般来说适合于从大分子量的复合物到整个细胞的
106道尔顿）显然无法研究。X射线晶体学也能达
形态与结构的研究，但其分辨率较低，早期人们对核糖体形态的认识都是基于电子显微镜（简称电镜）的方法；尽管现在的电镜三维重构方法已经有了飞速的发展，但在上个世纪七八十年代，用电镜到原子分辨率，且其研究的尺度比核磁共振方法大得多，从小分子无机物到生物大分子复合物都能研究，它是唯一有希望得到核糖体原子分辨率结构的方法，但是在之前很长一段时间里，核糖体这样如此巨大的复合物能否长出晶体都是一个有争议的问
第5期破解蛋白质翻译机器的结构与功能—
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题，更不用说衍射和求解相位。直到1980年Yona th发表了Bacillus ste arothermophilus核糖体大亚基的结晶实验[8]，人们才相信了X射线方法研究核糖体结构的可能性。虽然结晶被证明是可能的，但能够得到好的衍射数据才是至关重要的；对核糖体结晶条件的优化，从几乎没有衍射到出现衍射，花费
了研究人员十年多的时间[9～11]。许多核糖体晶体存在缺陷[12]，比如严重的不同晶、辐射损伤、晶体瑕疵、易碎、晶体镶嵌度（mosaicity）太大、衍射各向异性，甚至还出现片层状晶体[13]、孪晶[14] 等。此外，对于核糖体如此巨大的复合物晶体，其相位求解也是一件极其艰难的事情—
——从1991年得到3魡的衍射数据[15]到2000年解析第一个原子分辨率的结构[16]又花费了研究人员近十年的时间，这个过程充满了艰辛与无数次的失败。
3 核糖体结构功能研究历史
3.1起始阶段（上世纪80年代以前）：
1955年，Ge orge Pa la de首次用电镜观察到了核糖体[17]，因此核糖体在当时也被称作Palade颗粒（Pala de pa rticle），Pa la de本人也因此获得1974年的诺贝尔生理医学奖。1963年Waston发现核糖体分布在细胞内RNA丰富的地方，并且与内质网膜紧密地联系在一起[18]。核糖体的结构研究在上个世纪70年代就已经开始，当时主要是利用电镜直接观察并进行简单的三维重构，由于技术方法的限制，分辨率往往非常低。最早的大亚基结构是1976年Lake用电镜获得的[19]，分辨率只有40魡，只能看出其总体结构是一个直径约250魡的半球。
3.2探索阶段（上世纪80年代）：
1980年，M.Leijonmarck等解析了大肠杆菌核糖体结构蛋白L7/L12的2.6魡晶体结构，这是人们得到的第一个原子分辨率的核糖体组成蛋白的结构[20]。同年，Yona th报道了关于Bacillus stearothermophilus核糖体大亚基结晶实验[8]，使得利用X射线晶体学方法解析核糖体的结构成为可能，这极大地鼓舞了人们的信心。在此之后的近十年里，人们在晶体学方面的研究基本上都是在优化晶体（包括二维晶体和三维晶体）。到1987年，Yona th等得到Halobacterium marismortui核糖体大亚基6魡的衍射数据[9]。1988年，柏林的Garber研究小组获得了衍射到10～12魡的The rmus thermophilus核糖体30S小亚基的晶体[10]。到1991年，Yona th等将核糖体大亚基晶体的衍射分辨率提高到3魡[15]。
人们为了探索核糖体及其组成蛋白的结构，除了X射线晶体学方面的研究，还曾尝试过其它各种各样的方法，包括中子散射、免疫电镜、电镜单颗粒三维重构、电子晶体学、核磁共振谱等。从1986年到1987年，Ra ma krishna n等利用中子散射对大肠杆菌核糖体30S小亚基的21种蛋白质进行了成功定位，否定了过去由免疫电镜得到的关于结合蛋白在核酸外周的结论，证明了蛋白与核酸是交织在一起并相互作用的[21,22]。电子晶体学方面的一个重要成果是Yona th等利用电子晶体学方法得到B.stearothe rmophilus核糖体50S大亚基30魡的结构，发现了初生多肽的运输孔道[23]。这个时期J.Fra nk等则在尝试运用电镜单颗粒三维重构的方法研究核糖体的结构[24～27]。
3.3相位求解方法研究阶段：（上世纪90年代初～1998年）
对于核糖体的结构解析，一个至关重要的问题是如何确定相位。尽管在1987年人们就得到6魡的衍射数据[9]，其相位一直无法求解，研究者们做了许多尝试，直到1998年才看到了曙光[28]。
用传统的重金属同晶置换法求解相位的效果并不理想，因为相对于体积如此大的核糖体结构，单个重金属原子的散射能力已经显得微不足道了，不能引起低分辨率衍射点强度发生可测量的变化。人们只能寻其它方法，第一个被证明有效的方法是Yona th引入的，它使用了18个钨原子组成的钨原子簇代替单个原子进行同晶置换，从而为解决核糖体结构解析的相位问题奠定了基础[12]。
但是，由于钨原子簇对衍射强度变化的贡献随着分辨率的升高急剧下降，甚至不如同等数目散乱分布的单个重原子，因此仅仅利用钨原子簇同晶置换法没有办法得到更高分辨率的晶体结构，人们必须寻更好的结构测定方法。值得一提的是Fra nk 研究小组，他们从上个世纪80年代初就开始利用电镜三维重构来研究核糖体结构，到90年代中期已经获得了许多重要的突破，将分辨率提高到20魡左右[29～32]，这些结果对于最终解析核糖体晶体结构提供了重要的初始相位。
这段时期，Ram a krishna n等实验组获得了诸多核糖体组成蛋白的原子分辨率晶体结构，包括小亚基组成蛋白S4[33,34]、S5[35]、S6[36]、S7[37,38]、
S8[39,40]、S15[37,41～43]、S16[44]、S17[45]、S18[42]和
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S19[46]，以及大亚基组成蛋白L1[47]、L2[48]、L4[49]、L6[50]、L11[51, 52]、L7/12L[20]、14[53]、L22[54]和L30[55]，这些结果为整个核糖体原子分辨率结构解析也提供了重要的数据。
3.4突破阶段（1998年～2000年）
最重要的突破来自Ste itz的研究小组。1998 年，Ste itz的学生Ban利用钨簇方法并结合Frank 的低温电镜结果，率先获得了9魡的核糖体大亚基结构[28]。该结构给出了精确的A型RNA双螺旋的走向，从而为通过分子置换法求解相位提供了可能。一年后，他们又将分辨率进一步提高到了5魡[56]；同年，Ram a krishna n和Yona th实验组分别解析了Thermus the rmophilus核糖体小亚基5.5魡[14]和4.5魡[57]的晶体结构。此外，Rama krishna n实验组还确定了核糖体蛋白质翻译起始因子（initial factor）IF3在核糖体小亚基上的位置，也得到了T. maritime 结合蛋白L11 与RNA 的复合体结构，暗示了L11在反应中作为分子开关[52]。
在1999年，尽管研究者取得了突飞猛进的结果，但要想达到真正的原子分辨率还不是一件容易的事情，当时人们认为要完全破解核糖体结构之谜，还有很长的路要走。然而仅仅时隔一年，Steitz小组就首次解析了核糖体50S大亚基（来自H.ma rism ortui） 2.4魡的高分辨率晶体结构（图2A）[16]。虽然Yona th小组率先解析出3.6魡的核糖体大亚基结构，但该结构存在一些争议，他们也因此从蛋白质数据银行（PDB库）里撤销了该结构。第一个核糖体30S小亚基（来自
T.thermophilus） 3.3魡的晶体结构是Yona th小组率先解析的（图2B）[58]，紧随Yona th之后，Ra ma krishna n实验组发表了分辨率更高的核糖体小亚基的3.0魡晶体结构[59]。这些结构的成功解析也是他们赢得2009年诺贝尔化学奖最关键的原因。
3.5基于结构的功能研究阶段（但至今为止人们还没有获得真核核糖体晶体结构）
2000年以后，人们开始转向了核糖体与抗生素、tRNA和mRNA的复合体结构研究，并由此来对核糖体生物学功能的作用机理进行解释。
第一个得到抗生素与核糖体复合物结构的是Yonath 研究组，他们在2001 年解析了真细菌Deinoc occus radiodurans核糖体50S大亚基与多种抗生素的复合体[60]，为揭示其相互作用机理提供了重要依据。同年，Ra ma krishna n研究组还得到了到T.thermophilus在有无抗生素两种情况下核糖体30S小亚基与mRNA和tRNA复合物的3魡左右的晶体结构[61]以及其与起始因子IF1的复合体晶体结构[62]。2002年，Ram akrishna n研究组进一步揭示
崇文书局
第5期破解蛋白质翻译机器的结构与功能—
——2009年诺贝尔化学奖简述329
了核糖体tRNA选择机理的结构基础[63,64]，2003年他们又与Fra nk研究组合作利用冷冻电镜方法揭示了tm RNA（一种约300个核苷酸长度的RNA，同时具有tRNA和mRNA的功能，能够使得核糖体从有
缺陷的mRNA上脱落下来，并引导未完整翻译的新生肽链进行降解，从而保证核糖体翻译的准确性）进出核糖体的机理[65]，到2005年他们又得到T.thermophilus70S核糖体与释放因子（re le asing factor）RF1和RF2复合体的约6魡的晶体结构[66]，为揭示翻译如何终止提供了重要线索。2005年，Ste itz研究组在Cell上发表了突变后的核糖体大亚基与抗生素MLSBK的复合体结构，并合理解释了其抑制机理[67]；同时他们还在Nature上发表了肽酰基tRNA类似物与H.marismortui核糖体大亚基的复合物晶体结构并揭示了肽键形成的诱导契合机制与核糖体保护肽酰基tRNA不被水解的机理[68]；在同一期的Nature上，Fra nk研究组发表了70S核糖体与mRNA、tRNA结合复合体的冷冻电镜三维重构结构，分辨率为11魡，捕捉到了新生成肽链正被运送到PCC(prote in-conduc ting c ha nnel)的状态[69]。这些成果使人们对核糖体这样的复杂分子机器如何发挥生物学功能有了更加深入的了解。
完整的70S核糖体高分辨率晶体结构比较难获得，这对基于完整结构的功能研究带来了一些困难。第一个完整的70S核糖体(包括m RNA及A 位和P位tRNA）7.8魡晶体结构是在1999年由Noller H. F.小组解析[70]，两年后他们将分辨率提高到5.5魡[71]。最早的近原子分辨率3.5魡的70S核糖体在2005年由Schuwirth BS等解析[72]，但他们所解析的是没有结合任何mRNA和tRNA的空核糖体结构。2006年，Noller研究组最先得到了70S 核糖体与mRNA、tRNA复合物的近原子分辨率的3.7魡晶体结构[73]，遗憾的是，由于分辨率太低，他们轻率地断定70S核糖体与50S核糖体大亚基在反应中心(PT C）的结构大不一样，这个结论被Ra ma krishna n研究组解析的70S核糖体2.8魡的高分辨率结构(图2C）[7]以及
地源热泵换热其它诸多生化证据[74]或结构分析[75]所否定。随后，Gulna ra Yusupova1等解析了T.thermophilus70S完整核糖体与长m RNA复合体的结构[76]，首次看到了SD序列（shine-dalga rno se que nce）[77]并暗示了mRNA的运动机理。原子能
时至今日，基于结构的核糖体功能研究仍然在继续，这样一个如此复杂的生命机器还有着更多的谜团等待研究者们去揭开。
4 核糖体结构与功能研究的重大意义
核糖体的晶体结构解析极大地推动了人们对其微观反应机理的研究，这些研究使得人们加深了对中心法则的认识，更加清楚地了解了核糖体是如何获取mRNA所携带的基因信息并将其翻译为生命活动非常重要的功能执行者—
倒霉一词的来源于哪里——蛋白质。在没有获得核糖体精细结构以前，人们有一些普遍的认识[78,79]：核糖体的RNA就像一个支架将核糖体蛋白固定，以有助于蛋白质有效地发挥其催化功能；新生肽链在离开核糖体后在其表面增长延伸。这些观点被高分辨率的核糖体结构以及基于结构的功能研究彻底颠覆[16,58,59,80,81]，人们逐渐认识到了rRNA 在肽合成中的重要性，并且对初生肽的运输和保护机制开始重视。
高通滤波器设计
另一方面，核糖体结构功能研究又推动了新抗生素的开发进程。原核生物核糖体与真核生物核糖体在
结构上的差别是开发特异抗生素的基础，针对原核生物核糖体的抗生素能够有效地抑制原核生物核糖体发挥其功能，使其丧失合成自身所需蛋白的能力，同时又不使真核生物核糖体功能受阻，从而阻断细菌感染[82]。
通过对核糖体机理的深入了解，人们甚至可以在现有结构的基础上对其进行改造，使其能够结合人工tRNA和mRNA，达到合成具有特殊功能的多肽的目的。
核糖体原子分辨率晶体结构的成功解析在方法学上也具有极其重要的意义。作为一个没有对称性的复杂生物大分子机器，其结构的成功解析为人类探索其它复杂的生命机器树立了一个成功的典范，同时也积累了许多宝贵的经验。人们可以借助这些经验来研究更复杂的分子机器，对生命活动的物质结构基础有更加清楚的认识。
5 启示与展望
当回顾近15年的诺贝尔化学奖的时候，人们惊讶地发现其中的三分之一的桂冠被结构生物学家摘得。这也从另一个角度说明了，在原子层面上研究生命现象的重大理论意义。结构生物学的研究为
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