(19)中华人民共和国国家知识产权局
| (12)发明专利说明书 | |
| (10)申请公布号 CN 101070550 A (43)申请公布日 2007.11.14 |
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(21)申请号 CN200710008928.4
(22)申请日 2007.04.29
(71)申请人 厦门大学
地址 361005 福建省厦门市思明南路422号
(72)发明人 郑忠辉 黄珊珊 杜希萍 黄耀坚 宋思扬 沈月毛
(74)专利代理机构 厦门南强之路专利事务所
代理人 马应森
(51)Int.CI
(54)发明名称
(57)摘要
克列维醇的制备方法及在制抗乙酰胆碱酯酶药物的应用，涉及一种克列维醇。提供一种来源于红树林内生真菌次级代谢产物克列维醇的制备方法和应用。制备方法为：矮棒曲霉BYY－1种子培养；液体深层发酵；发酵液过滤除菌体；滤液减压浓缩后用有机溶剂多次萃取，收集有机相并减压浓缩获得粗提物；粗提物经硅胶柱谱及重结晶精制后制得克列维醇。克列维醇对乙酰胆碱酯酶具有显著的抑制作用，是一种可逆性的乙酰胆碱酯酶抑制剂，可用于制备早老性痴呆及其它与乙酰胆碱缺乏相关的疾病的药物。 | |
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法律状态
权 利 要 求 说 明 书
1.克列维醇的制备方法，所述的克列维醇来源于红树林内生真菌次级代谢产物，红树林内生真菌为矮棒曲霉BYY-1(Aspergillus clavatonanicus BYY-1)，已于2006年7月3日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏号为CCTCC NO：M206063，所述的克列维醇为2，4-Dihydroxy-3，5-dimethylacetophenone，其化学结构式如下：
其特征在于包括以下步骤：
1)矮棒曲霉BYY-1(Aspergillus clavatonanicus BYY-1)的种子培养
A.配制斜面培养基：马铃薯去皮切块，放入海水中，煮后过滤，滤液用海水定容，得马铃薯 汁，然后添加葡萄糖或蔗糖及琼脂，分装试管，灭菌后制成斜面培养基，将矮棒曲霉BYY-1转接至斜面培养基上培养；
B.配制种子液：在马铃薯汁中添加葡萄糖或蔗糖，分装后灭菌，得种子培养基，将培养的斜面菌种接入到分装后的种子培养基中，摇瓶培养，得种子液；
C.种子罐种子培养：先配制种子培养基，将种子培养基装入种子罐，将培养的种子液接入种子罐中，培养后得培养后的种子液；
2)克列维醇的发酵
配制发酵培养基，将发酵培养基装入发酵罐，将培养后的种子液接入发酵罐中，发酵后得发酵液；
3)克列维醇的提取
将发酵液过滤除菌体，滤液减压浓缩后用有机溶剂萃取，收集有机相并减压浓缩成浸膏；
4)克列维醇的精制
浸膏用甲醇溶解得克列维醇甲醇溶液，在克列维醇甲醇溶液中加入硅胶拌样，上硅胶柱进行分离，以石油醚/乙酸乙酯为洗脱剂梯度洗脱，收集当石油醚/乙酸乙酯的体积比例为50～3∶1时的洗脱液，合并洗脱液并减压浓缩至干，得微黄晶体，加溶剂溶解后重结晶至少2次，得目标产物，即克列维醇，石油醚/乙酸乙酯＝100/0到0/100。
2.如权利要求1所述的克列维醇的制备方法，其特征在于在步骤1)中，配制斜面培养基的马铃薯去皮切成小块，取150～300g放入1L 20％～100％海水中，煮后过滤，滤液用20％～100％海水定容至1000ml，得马铃薯汁。
3.如权利要求1所述的克列维醇的制备方法，其特征在于在步骤1)中，添加葡萄糖或蔗糖的量为10～30g，琼脂1.5～3.0g，分装试管，121℃灭菌30min后制成斜面培养基，将矮棒曲霉BYY-1转接至斜面培养基上后25～32℃下培养3～7d。
4.如权利要求1所述的克列维醇的制备方法，其特征在于在步骤1)中，配制种子液时，在每升马铃薯汁中添加葡萄糖或蔗糖10～30g，分装后121℃灭菌30min，得种子培养基，将培养的斜面菌种接入到分装后的种子培养基中，25～32℃下，120～250r/min摇瓶培养2～5d，得种子液。
5.如权利要求1所述的克列维醇的制备方法，其特征在于在步骤1)中，种子罐种子培养时，将种子培养基装入种子罐的装罐量为种子罐容积的60％～70％，将培养的种子液按接种量2％～10％接入种子罐中，在温度25～32℃、搅拌转速120～220r/min和通气量0.3～1.2vvm的条件下培养2～4d，得培养后的种子液。
6.如权利要求1所述的克列维醇的制备方法，其特征在于在步骤2)中，配制发酵培养基时，将发酵培养基装入发酵罐的装罐量为发酵罐容积的60％～70％，将培养后的种子液按接种量5％～10％接入发酵罐中，在温度25～32℃、搅拌转速120～200r/min和通气量0.3～1.5vvm的条件下发酵4～7d，得发酵液。
7.如权利要求1所述的克列维醇的制备方法，其特征在于在步骤3)中，将发酵液过滤除菌体，滤液减压浓缩至发酵液体积的35％～20％后用有机溶剂萃取至少2次，收集有机相并减压浓缩成浸膏。
8.如权利要求1所述的克列维醇的制备方法，其特征在于在步骤3)中，有机溶剂选自乙酸乙酯、氯仿、四氯化碳、甲苯中的一种。
9.如权利要求1所述的克列维醇的制备方法，其特征在于在步骤4)中，在克列维醇甲醇溶液中加入质量为浸膏5～10倍的硅胶拌样，收集当石油醚/乙酸乙酯的体积比例为(50～3)/1时的洗脱液，溶剂选自甲醇、乙酸乙酯和丙酮中的一种。
10.如权利要求1所述的克列维醇在制备早老性痴呆及其它与乙酰胆碱缺乏相关的疾病药物中的应用。
说 明 书
技术领域
本发明涉及一种克列维醇(clavatol)，尤其是涉及一种来源于红树林内生真菌一矮棒曲霉BYY-1(A.clavatonanicus)真菌代谢产物克列维醇化合物的制备方法，以及该化合物在制备早老性痴呆及其它与乙酰胆碱缺乏相关的疾病药物中的新用途。
背景技术
老年性痴呆病是一种神经退化性的疾病，在65～69岁的老年人口中发病率约为10％，85岁
以上的患病率约为47％，而且仍在增长之中。老年性痴呆病严重危害老年人的健康和生活质量，患病后会使病人逐渐丧失学习和记忆能力，产生严重的生活自理障碍并导致死亡。
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