(19)中华人民共和国国家知识产权局
| (12)发明专利说明书 | |
| (10)申请公布号 CN 1650019 A (43)申请公布日 2005.08.03 |
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(21)申请号 CN03810041.X
(22)申请日 2003.04.29
(71)申请人 拜尔生物科学公司
地址 比利时根特
(72)发明人 S·简森斯 M·奥邦 A·雷纳尔特斯
(74)专利代理机构 北京市中咨律师事务所
代理人 黄革生
(51)Int.CI
C12N15/82
A01H5/00
(54)发明名称
(57)摘要
本发明涉及制备植物的方法，其中所述植物中杀昆虫蛋白的表达受到诱导局部表达的创伤诱导型启动子，优选创伤诱导型TR2’启动子的调节；还涉及该方法中使用的嵌合基因以及由此得到的植物；还涉及通过昆虫进食导致的植物损伤来诱导杀昆虫蛋白的局部表达，从而对在植物上进食的昆虫产生抗性的方法。 | |
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法律状态
法律状态公告日 | 法律状态信息 | 法律状态 |
2022-04-08 | 未缴年费专利权终止IPC(主分类):C12N15/82专利号:ZL03810041X申请日:20030429授权公告日:20070404 | 专利权的终止 |
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权 利 要 求 说 明 书
<Claim>1.具有抗昆虫抗性的单子叶植物、植物细胞或组织，其基因组中稳定整合有包含处于含有TR2’启动子的启动子区控制下的编码杀昆虫蛋白的DNA序列的嵌合基因。
<Claim>2.权利要求1的植物、细胞或组织，其中所述植物、细胞或组织表达高剂量的所述杀昆虫蛋白。
<Claim>3.权利要求1或2的植物、细胞或组织，其中所述植物、细胞或组织为玉米植物、细胞或组织并且其中在10天的生物分析中所述玉米植物、细胞或组织杀死至少97％的四龄欧洲玉米螟幼虫。
<Claim>4.权利要求1到3任一项的植物、细胞或组织，其中所述杀昆虫蛋白为苏云金芽孢杆菌毒素。
<Claim>5.权利要求1到4任一项的植物、细胞或组织，其中所述TR2’启动子为SEQ ID NO：1的启动子。
<Claim>6.在单子叶植物中获得杀昆虫毒素的创伤诱导表达的方法，所述方法包括向该植物导入含有嵌合基因的外来DNA，该嵌合基因包含：
a)编码杀昆虫蛋白的DNA序列，和
b)含有TR2’启动子的植物可表达的启动子区。
<Claim>7.权利要求6的方法，其中所述单子叶植物表达高剂量的所述杀昆虫蛋白。
<Claim>8.权利要求6或7的方法，其中所述单子叶植物为玉米并且其中在10天的生物分析中所述玉米植物杀死至少97％的四龄欧洲玉米螟幼虫。
<Claim>9.权利要求6到8任一项的方法，其中所述单子叶植物为玉米并且其中所述创伤诱导表达的特征在于在温室生长的植物中所述植物的叶中杀昆虫蛋白的平均基础表达水平为总可溶蛋白的0.005％或更少。
<Claim>10.制备具有抗昆虫抗性的单子叶植物的方法，所述方法包括向所述植物的基因组中导入含有嵌合基因的外来DNA，所述嵌合基因含有：
a)编码杀昆虫蛋白的DNA序列，和
b)含有TR2’启动子的植物可表达的启动子区。
<Claim>11.权利要求10的方法，其中所述单子叶植物表达高剂量的所述杀昆虫蛋白。
<Claim>12.权利要求10或11的方法，其中所述单子叶植物为玉米并且其中在10天的生物分析中所述玉米植物杀死至少97％四龄欧洲玉米螟幼虫。
<Claim>13.权利要求10到12任一项的方法，其中所述单子叶植物为玉米，并且其中所述创伤诱导表达的特征在于在温室生长的植物中所述植物叶中杀昆虫蛋白的平均基本表达水平为总可溶蛋白的0.005％或更少。
<Claim>14.在单子叶植物中使杀昆虫蛋白在创伤时增加表达的方法，其中温室中所述植物的叶中的平均表达水平在没有受到创伤时为总可溶蛋白的0.005％或更少，而在受伤时所述平均表达水平增加至少5倍，所述方法包括向所述植物的基因组中导入含有嵌合基因的外来DNA，所述嵌合基因含有：
a)编码杀昆虫蛋白的DNA序列，和
b)含有TR2’启动子的植物可表达的启动子区。
<Claim>15.权利要求14的方法，其中所述单子叶植物为玉米并且其中在10天的生物分析中所述玉米植物杀死至少97％的四龄欧洲玉米螟幼虫。
<Claim>16.权利要求14或15的方法，其中所述植物为玉米并且其中在V4期的叶中测量到的所述基础表达水平为0.005％或更少。
<Claim>17.根据权利要求14到16任一项的方法，其中所述杀昆虫蛋白为Bt蛋白。
<Claim>18.权利要求17的方法，其中所述Bt蛋白选自Cry1 Ab、Cry1F、Cry2Ae、Cry9C和Cry2Ab以及其杀昆虫片段。
<Claim>19.权利要求1的植物、细胞或组织，其中所述蛋白为SEQ ID NO：3编码的蛋白。
<Claim>20.权利要求4的植物、细胞或组织，其中所述Bt蛋白选自Cry1 Ab、Cry1F、Cry2Ae和Cry2A以及其杀昆虫片段。
<Claim>21.用于权利要求6到18任一项的方法中的嵌合基因。
说 明 书
发明领域
本发明涉及制备植物的方法，所述植物中杀昆虫蛋白在诱导局部表达的创伤诱导启动子，优选TR2’创伤诱导型启动子的调节下表达；本发明还涉及该方法中使用的嵌合基因和由此得到
的植物，以及通过在昆虫进食伤害植物时诱导杀昆虫蛋白局部表达来抵抗食用植物的昆虫的方法。
背景技术
在制备抵抗昆虫进攻的植物的尝试中，大多数通过并且被认为依赖于高水平表达杀昆虫毒素获得了成功(Estruch等，1997；Witowsky &Siegfried，1997)。最尤其是Bt毒素，其作为全长蛋白被发现在植物中表达不足，研究工作集中于通过使用强组成型启动子和通过修饰编码它们的基因来增加这些毒素的表达(Vaeck等，1987；Barton等，1987)。最近，有人提出在易受攻击的组织中或者通过昆虫进食引发来空间调节杀昆虫蛋白的表达可能为抗性操纵提供好处(Peferoen & Van Rie，1997)。对于转基因昆虫抗性植物，获得管理机构批准的一个主要条件是昆虫抗性操纵策略的实用性。目前有利的策略是将转基因植物对靶害虫的100％毒性(通过高剂量表达特定毒素并且在害虫的整个生命周期中进行表达来实现)和非转基因植物的庇护作用(这使得靶害虫体得以维持)联合起来(De Maagd等1999)。为了能够遵守这种策略，在制备昆虫抗性植物时强组成性启动子的使用得到了进一步的鼓励。
昆虫抗性的诱导型表达最初在马铃薯蛋白酶抑制剂基因(pin I和pin 2)上进行了检查，该基因
是植物自然防御系统的一部分，其确保在植物受创后在整株植物中产生全身性信号(Green和Ryan，1972；Hilder等1987)。稻中pin 2基因的导入导致稻植株中该蛋白的高水平全身性积累，该植株显示出对主要害虫的增加的抗性(Duan等，1996)。Breitler等(2001)描述了使用玉米蛋白酶抑制剂(MPI)基因的C1区来驱动稻中cry 1B编码序列的创伤诱导表达，发现第一代转化株可以有效地保护稻抵抗钻心虫攻击，在此创伤诱导表达被描述为局部的和全身性的。
在小规模实验室实验中，用置于大豆诱导型vspB启动子控制下的cry1Ab3基因转化的转基因甘蓝叶和用置于35S启动子控制下的相同基因转化的叶对小菜蛾一样具有毒性，但是没有显示出创伤诱导性(Jin等，2000)。
根癌农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)的甘露碱合酶基因的TR2’启动子(最初被认为指导组成型表达)((Velten等1984；Vaeck等1987)已经被用于指导番茄中天然Cry1Ab基因的创伤诱导型表达，其导致相对低的表达和仅仅中等的昆虫控制水平(Reynaerts & Jansens，1994)。尽管已有人提出可以广泛应用于Bt蛋白表达(Peferoen，1997)，但是对烟草和其他双子叶植物中TR2’启动子的表达模式的报导却存在分歧(Ni等，1995)。通常，优选使用单子叶植物启动子以在单子叶植物中最优表达基因(Shimamoto，1994)并且已经发现一些启动子在单子叶
植物和双子叶植物中具有不同的顺式作用元件(Luan等，1992)。在玉米原生质体中研究了TR2’启动子的不同元件对其活性的贡献(Fox等，1992)，但是没有关于单子叶植物中TR2’启动子的表达模式的报导。此外，发现最强的缺失突变体的活性比CaMV35S启动子活性低20倍(Fox等，1992)。
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