(19)中华人民共和国国家知识产权局
(12)发明专利申请
(10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请号 202010557662.4
(22)申请日 2020.06.18
(71)申请人 中国人民解放军联勤保障部队第九
二〇医院
地址 650000 云南省昆明市西山大观路212
号
(72)发明人 阮光萍 姚翔 潘兴华 庞荣清
(74)专利代理机构 北京化育知识产权代理有限
公司 11833
代理人 尹均利
(51)Int.Cl.
C12N 5/074(2010.01)
(54)发明名称
的方法
(57)摘要
制备拟胚体的方法，涉及生物技术领域。该诱导
多能干细胞快速高效制备拟胚体的方法，包括以
离；S3.分配至多个培养皿中继续培养；S4.去除
杂质；S5.进行离心；S6.重悬培养，形成球状物；
S7.将细胞球体继续培养，形成拟胚体。通过培养
重新聚合培养，形成拟胚体，使细胞能够以最快
生长速度进行分裂，形成拟胚体的时间缩短，加
快了拟胚体的制备，通过离心细胞，使细胞挤压
成片状细胞，然后通过收集、聚拢重悬于培养基
中进行培养，使细胞在培养成拟胚体的过程中形
成球状，
不易于松散。权利要求书1页 说明书4页CN 111647552 A 2020.09.11
C N 111647552
A
1.一种诱导多能干细胞快速高效制备拟胚体的方法，其特征在于：包括以下步骤：S1.将多能干细胞在多能干细胞培养基中，进行培养多能干细胞团块；
S2.将培养的多能干细胞通过消化剂消化为单个细胞或者较小的多能干细胞团块；S3.将消化后的多能干细胞按照1×106的细胞数接种至直径100mm的培养皿中，对干细胞继续进行培养；
S4.将培养后的细胞进行过滤，去除杂质；
S5.将过滤后的细胞利用微孔板材进行离心，经过离心，形成紧压的细胞；
S6.将细胞进行收集、聚拢，重悬于分化培养基中，使其形成较紧实的细胞球体；S7.将细胞球体继续培养，形成拟胚体。
2.根据权利要求1所述的一种诱导多能干细胞快速高效制备拟胚体的方法，其特征在于：所述多能干细胞培养基包括F12培养基、DMEM营养成分、碳酸氢钠、硒酸钠、胰岛素生长因子、铁蛋白、转化生长因子。转化生长因子，可以使多能干细胞多能性不变，而且细胞能够正常生长。
3.根据权利要求1所述的一种诱导多能干细胞快速高效制备拟胚体的方法，其特征在于：所述培养皿中的培养基为多功能干细胞培养基，所述培养时间为2～4天，所述细胞通过细胞过滤筛网进行过滤，所述细胞通过细胞过滤筛网进行过滤。转化生长因子，可以使多能干细胞多能性不变，而且细胞能够正常生长。
4.根据权利要求1所述的一种诱导多能干细胞快速高效制备拟胚体的方法，其特征在于：所述杂质为培养基的营养物质、死亡细胞、破碎细胞以及游离的单个细胞。转化生长因子，可以使多能干细胞多能性不变，而且细胞能够正常生长。
5.根据权利要求1所述的一种诱导多能干细胞快速高效制备拟胚体的方法，其特征在于：所述离心通过离心机与微孔板材结合实现，转速为700～1500r/min ，所述离心时长为8～12分钟。
6.根据权利要求1所述的一种诱导多能干细胞快速高效制备拟胚体的方法，其特征在于：所述消化剂的材料为胰蛋白酶—乙二胺四乙酸消化液，所用浓度为0.1％～0.25％。
权 利 要 求 书1/1页CN 111647552 A
一种诱导多能干细胞快速高效制备拟胚体的方法
技术领域
[0001]本发明涉及生物技术领域，具体为一种诱导多能干细胞快速高效制备拟胚体的方法。
背景技术
[0002]多能干细胞是一类具有自我更新、自我复制能力的多潜能细胞。在一定条件下，它可以分化成多种APSC多能细胞，多能干细胞具有分化出多种细胞组织的潜能，但失去了发育成完整个体的能力，发育潜能受到一定的限制，真正意义上的哺乳动物全能干细胞只有受精卵和卵裂早期细胞。它们不仅可以分化产生三胚层中各类型细胞，还能发育成胎盘组织，最终产生子代个体。多能干细胞通常在一定条件下，能分化产生3个胚层中各种类型细胞并形成器官的一类细胞。
[0003]多能干细胞在进行转化为其他细胞，对于器官再生、修复以及疾病发面有较大的效果，而且在进行转化之前需要对干细胞进行拟坯体的培养，然后通过各种分化手段进行定向诱导分化为目的细胞，模拟体内胚胎发育过程，现有技术对于拟胚体的培养较为缓慢，使得实验进度缓慢。
发明内容
[0004](一)解决的技术问题
[0005]针对现有技术的不足，本发明提供了一种诱导多能干细胞快速高效制备拟胚体的方法，解决了拟胚体培养较为缓慢的问题。
[0006](二)技术方案
[0007]为实现以上目的，本发明通过以下技术方案予以实现：一种诱导多能干细胞快速高效制备拟胚体的方法，包括以下步骤：
[0008]S1.将多能干细胞在多能干细胞培养基中，进行培养多能干细胞团块；
[0009]S2.将培养的多能干细胞通过消化剂消化为单个细胞或者较小的多能干细胞团块；
[0010]S3.将消化后的多能干细胞按照1×106的细胞数接种至直径100mm的培养皿中，对干细胞继续进行培养；
[0011]S4.将培养后的细胞进行过滤，去除杂质；
[0012]S5.将过滤后的细胞利用微孔板材进行离心，经过离心，形成紧压的细胞；[0013]S6.将细胞进行收集、聚拢，重悬于分化培养基中，使其形成较紧实的细胞球体；[0014]S7.将细胞球体继续培养，形成拟胚体。
[0015]优选的，所述多能干细胞培养基包括F12培养基、DMEM营养成分、碳酸氢钠、硒酸钠、胰岛素生长因子、铁蛋白、转化生长因子。
[0016]优选的，所述培养皿中的培养基为多功能干细胞培养基，所述培养时间为2～4天，所述细胞通过细胞过滤筛网进行过滤。
[0017]优选的，所述杂质为培养基的营养物质、死亡细胞、破碎细胞以及游离的单个细胞。
[0018]优选的，所述离心通过离心机与微孔板材结合实现，转速为 700～1500r/min，所述离心时长为8～12分钟。
[0019]优选的，所述消化剂的材料为胰蛋白酶—乙二胺四乙酸消化液，所用浓度为0.1％～0.25％。
[0020](三)有益效果
[0021]本发明提供了一种诱导多能干细胞快速高效制备拟胚体的方法。具备以下有益效果：
[0022]1、本发明通过培养干细胞，消化液进行分离，多个培养基再次培养，重新聚合培养，形成拟胚体，使细胞能够以最快生长速度进行分裂，形成拟胚体的时间缩短，加快了拟胚体的制备。
[0023]2、该发明通过离心细胞，使细胞挤压成片状细胞，然后通过收集、聚拢重悬于培养基中进行培养，使细胞在培养成拟胚体的过程中形成球状，不易于松散。
具体实施方式
[0024]下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
[0025]实施例一：
[0026]本发明实施例提供一种诱导多能干细胞快速高效制备拟胚体的方法，包括以下步骤：
[0027]S1.将多能干细胞在多能干细胞培养基中，进行培养多能干细胞团块；
[0028]S2.将培养的多能干细胞通过消化剂消化为单个细胞或者较小的多能干细胞团块；
[0029]S3.将消化后的多能干细胞按照1×106的细胞数接种至直径100mm的培养皿中，对干细胞继续进行培养；
[0030]S4.将培养后的细胞进行过滤，去除杂质；
[0031]S5.将过滤后的细胞利用微孔板材进行离心，经过离心，形成紧压的细胞；[0032]S6.将细胞进行收集、聚拢，重悬于分化培养基中，使其形成较紧实的细胞球体；[0033]S7.将细胞球体继续培养，形成拟胚体。
[0034]多能干细胞培养基包括F12培养基、DMEM营养成分、碳酸氢钠、硒酸钠、胰岛素生长因子、铁蛋白、转化生长因子，可以使多能干细胞多能性不变，而且细胞能够正常生长，培养皿中的培养基为多功能干细胞培养基，培养时间为2～4天，细胞通过细胞过滤筛网进行过滤，杂质为培养基的营养物质、死亡细胞、破碎细胞以及游离的单个细胞。
[0035]离心通过离心机与微孔板材结合实现，转速为700r/min，离心时长为12 分钟，消化剂的材料为胰蛋白酶—乙二胺四乙酸消化液，所用浓度为0.1％。
[0036]实施例二：
[0037]本发明实施例提供一种诱导多能干细胞快速高效制备拟胚体的方法，包括以下步骤：
[0038]S1.将多能干细胞在多能干细胞培养基中，进行培养多能干细胞团块；
[0039]S2.将培养的多能干细胞通过消化剂消化为单个细胞或者较小的多能干细胞团块；
[0040]S3.将消化后的多能干细胞按照1×106的细胞数接种至直径100mm的培养皿中，对干细胞继续进行培养；
[0041]S4.将培养后的细胞进行过滤，去除杂质；
[0042]S5.将过滤后的细胞利用微孔板材进行离心，经过离心，形成紧压的细胞；[0043]S6.将细胞进行收集、聚拢，重悬于分化培养基中，使其形成较紧实的细胞球体；[0044]S7.将细胞球体继续培养，形成拟胚体。
[0045]多能干细胞培养基包括F12培养基、DMEM营养成分、碳酸氢钠、硒酸钠、胰岛素生长因子、铁蛋白、转化生长因子，可以使多能干细胞多能性不变，而且细胞能够正常生长，培养皿中的培养基为多功能干细胞培养基，培养时间为2～4天，细胞通过细胞过滤筛网进行过滤，杂质为培养基的营养物质、死亡细胞、破碎细胞以及游离的单个细胞。
[0046]离心通过离心机与微孔板材结合实现，转速为900r/min，离心时长为10 分钟，消化剂的材料为胰蛋白酶—乙二胺四乙酸消化液，所用浓度为0.15％。
[0047]实施例3：
[0048]本发明实施例提供一种诱导多能干细胞快速高效制备拟胚体的方法，包括以下步骤：
[0049]S1.将多能干细胞在多能干细胞培养基中，进行培养多能干细胞团块；
[0050]S2.将培养的多能干细胞通过消化剂消化为单个细胞或者较小的多能干细胞团块；
[0051]S3.将消化后的多能干细胞按照1×106的细胞数接种至直径100mm的培养皿中，对干细胞继续进行培养；
[0052]S4.将培养后的细胞进行过滤，去除杂质；
[0053]S5.将过滤后的细胞利用微孔板材进行离心，经过离心，形成紧压的细胞；[0054]S6.将细胞进行收集、聚拢，重悬于分化培养基中，使其形成较紧实的细胞球体；[0055]S7.将细胞球体继续培养，形成拟胚体。
[0056]多能干细胞培养基包括F12培养基、DMEM营养成分、碳酸氢钠、硒酸钠、胰岛素生长因子、铁蛋白、转化生长因子，可以使多能干细胞多能性不变，而且细胞能够正常生长，培养皿中的培养基为多功能干细胞培养基，培养时间为2～4天，细胞通过细胞过滤筛网进行过滤，杂质为培养基的营养物质、死亡细胞、破碎细胞以及游离的单个细胞。
[0057]离心通过离心机与微孔板材结合实现，转速为1200r/min，离心时长为89 分钟，消化剂的材料为胰蛋白酶—乙二胺四乙酸消化液，所用浓度为0.2％。
[0058]实施例四：
[0059]本发明实施例提供一种诱导多能干细胞快速高效制备拟胚体的方法，包括以下步骤：
[0060]S1.将多能干细胞在多能干细胞培养基中，进行培养多能干细胞团块；
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