(19)中华人民共和国国家知识产权局
(12)发明专利申请
(10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请号 201910310597.2
(22)申请日 2019.04.17
(71)申请人 桂林理工大学
地址 541004 广西壮族自治区桂林市建干
路12号
(72)发明人 朱春蓓 贾玉虎 何丽 廖建宇
陈慧英
(51)Int.Cl.
C12N 9/42(2006.01)
(54)发明名称
一种采用粗糙脉孢菌利用罗汉果皮渣固体
(57)摘要
本发明公开了采用粗糙脉孢菌利用罗汉果
源、碳氮比、金属离子、诱导剂、温度对内切酶活
的影响，选取C/N比、Mg 2+、苯酚这三个因素，设计
三因素四水平的正交试验，以确定最优的固体发
酵条件。本发明具有工艺简便，成本低，生产原料
易获取，内切酶活高等优点。
同时，固体发酵工艺
更接近粗糙脉孢菌的生长环境。权利要求书2页 说明书6页CN 110055239 A 2019.07.26
C N 110055239
A
权 利 要 求 书1/2页CN 110055239 A
1.一种采用粗糙脉孢菌利用罗汉果皮渣固体发酵产纤维素内切酶的方法，其特征包括以下步骤： (1)菌种保存培养基：马铃薯葡萄糖琼脂培养基(PDA培养基)； (2)产酶培养基：在250mL锥形瓶中加入5.00g罗汉果皮渣，按料水比1:3加入15mL水，培养基在121℃，20min条件下灭菌；
(3)固体发酵工艺：用打孔器打一孔菌种(菌种处于对数生长期)接到产酶培养基上，搅拌均匀，30℃培养；
(4)酶液制备：发酵6d后，适量pH5.0柠檬酸钠-柠檬酸缓冲液加入到发酵基质中，5000r/min离心10min，经滤纸过滤后，所得滤液为制得的酶液，在4℃保存；
(5)内切酶活测定：加入2.0mL1％CMCNa(w/v)溶液(溶于0.1mol/L柠檬酸钠-柠檬酸缓冲液，pH5.0)在比管中，加入适当稀释后的酶液步骤(4)0.5mL，保温30min，加入2.5mL DNS，沸水浴5min，立即用冷水冷却至室温，测定OD540，同时以100℃灭活15min的酶液作对照；
酶活定义：反应条件下，内切酶每分钟催化底物水解产生1μg葡萄糖所需的酶量为1个酶活力单位(U)；
(6)产酶曲线的绘制：用12个250mL的锥形瓶，准确称取5.00g步骤(2)罗汉果皮渣，添加0-0.25g乳糖，将菌种步骤(1)接种到产酶培养基步骤(3)，在30℃培养1-12d后，提取酶液步骤(4)，测定其内切酶活步骤(5)，绘制出产酶曲线，确定接种时间和终止固体发酵的时间；
(7)最佳碳源、氮源的筛选碳源筛选：准确称取5.00g步骤(2)罗汉果皮渣，将菌种步骤(1)接种到产酶培养基步骤(3)，只改变产酶培养基中碳源类型，其他条件不变，出最适合粗糙脉孢菌生长、产酶的碳源；氮源筛选：只改变产酶培养基中氮源的种类，其他条件不变，出最适合粗糙脉孢菌生长、产酶的氮源，从产酶曲线步骤(6)知终止发酵时间，提取酶液步骤(4)，测定其内切酶活步骤(5)；
(8)最适碳源、氮源添加量筛选：准确称取5.00g步骤(2)罗汉果皮渣，将菌种步骤(1)接种到产酶培养基步骤(3)，在确定最佳碳源、氮源的条件下，只改变产酶培养基中最佳碳源、氮源的添加量，分别设置梯度0.01g-0.25g，筛选出最佳碳源和氮源的添加量，从产酶曲线步骤(6)知终止发酵时间，提取酶液步骤(4)，测定其内切酶活步骤(5)；
(9)最适C/N比筛选：准确称取5.00g步骤(2)罗汉果皮渣，将菌种步骤(1)接种到产酶培养基步骤(3)，筛选出最合适的碳源和氮源后，其他条件不变，固定碳源质量为0.05g，改变氮源的质量，使得C/N比分别为1:20-50:1，从产酶曲线步骤(6)知终止发酵时间，提取酶液步骤(4)，测定其内切酶活步骤(5)；
(10)金属离子对酶活的影响：准确称取5.00g步骤(2)罗汉果皮渣，添加最佳C/N比步骤(10)，将菌种步骤(
1)接种到产酶培养基步骤(3)，加入各种金属离子，质量浓度分别为以下几个梯度：0.1-1.5mg/mL，确定最佳离子的最佳浓度，从产酶曲线步骤(6)知终止发酵时间，提取酶液步骤(4)，测定其内切酶活步骤(5)；
(11)温度对酶活的影响：准确称取5.00g步骤(2)罗汉果皮渣，添加最佳C/N比步骤(10)，将菌种步骤(1)接种到产酶培养基步骤(3)，选择不同温度4℃-40℃，考察温度对产酶的影响，从产酶曲线步骤(6)知终止发酵时间，提取酶液步骤(4)，测定其内切酶活步骤(5)。
(12)诱导剂对酶活的影响：准确称取5.00g步骤(2)罗汉果皮渣，添加最佳C/N比步骤
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