(19)中华人民共和国国家知识产权局
(12)发明专利申请
(10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请号 201910272425.0
(22)申请日 2019.04.04
中心
地址 200031 上海市徐汇区岳阳路320号35
号楼
(72)发明人 程新 邓小刚 吴佳颖 付天龙
(74)专利代理机构 上海一平知识产权代理有限
公司 31266
代理人 王正君 徐迅
(51)Int.Cl.
C12N 5/10(2006.01)
C12N 5/0735(2010.01)
A61K 35/545(2015.01)
A61P 1/16(2006.01)
A61P 1/00(2006.01)A61P 3/10(2006.01)C12Q 1/02(2006.01)
(54)发明名称
法及其应用
(57)摘要
本发明提供了诱导分化细胞成多潜能内胚
层干细胞的方法及其应用，具体地，本发明提供
了一种诱导人类分化细胞(Differentiated
Cell)分化为诱导多潜能内胚层干细胞(smEnSC)
的方法，包括步骤：(a)在第一培养条件下，在培
养体系中培养分化细胞，从而获得诱导多潜能内
胚层干细胞(smEnSC)；其中，所述培养体系包括
EGF、A83‑01和CHIR99021。本发明的功能性的诱
导多潜能内胚层干细胞具有非常高的分化率和
纯度。权利要求书1页 说明书13页 附图3页CN 111778213 A 2020.10.16
C N 111778213
A
1.一种诱导人类分化细胞分化为诱导多潜能内胚层干细胞(smEnSC)的方法，其特征在于，包括步骤：
(a)在第一培养条件下，在培养体系中培养分化细胞，从而获得诱导多潜能内胚层干细胞(smEnSC)；其中，所述培养体系包括EGF、A83-01和CHIR99021。
2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述分化为退分化。
3.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述分化细胞包括成体细胞。
4.如权利要求3所述的方法，其特征在于，所述成体细胞选自下组：肝实质细胞、胃上皮细胞、胰岛细胞、小肠上皮细胞、或其组合。
5.一种诱导多潜能内胚层干细胞，其特征在于，所述的诱导多潜能内胚层干细胞由权利要求1所述的方法制备获得。
6.一种内胚层衍生细胞，其特征在于，所述内胚层衍生细胞为三维球状结构，其中，所述内胚层衍生细胞的球囊直径大小为100－500μm。
7.一种权利要求5所述的诱导多潜能内胚层干细胞、或权利要求6所述的内胚层衍生细胞的用途，其特征在于，用于制备药物或制剂，所述药物或制剂用于(a)肝脏、胆管相关疾病；和/或(b)肠道疾病；和/或(c)糖尿病。
8.一种诱导培养基，其特征在于，所述诱导培养基含有基础培养基和添加物；其中所述基础培养基选自下组：SFD、DMEM、DMEM/F12、BDM、或其组合；并且，所述添加物包括EGF、A83-01和CHIR99021。
9.一种权利要求8所述的诱导培养基的用途，其特征在于，用于诱导分化细胞分化为诱导多潜能内胚层干细胞(smEnSC)。
10.一种筛选或确定促进分化细胞分化为诱导多潜能内胚层干细胞(smEnSC)的潜在剂的方法，其特征在于，包括步骤：
(a)在测试组中，在培养体系中，在测试化合物的存在下，培养分化细胞一段时间T1，检测测试组所述培养体系中的诱导多潜能内胚层干细胞的数量M1；
并且在不存在所述测试化合物且其他条件相同的对照组中，检测对照组所述培养体系中的诱导多潜能内胚层干细胞的数量M2；和
(b)将上一步骤所检测的M1、M2进行比较，从而确定所述测试化合物是否是促进分化细胞分化为诱导多潜能内胚层干细胞的潜在剂；
其中，如果M1显著高于M2，则表示所述测试化合物是促进分化细胞分化为诱导多潜能内胚层干细胞的潜在剂。
权 利 要 求 书1/1页CN 111778213 A
诱导分化细胞成多潜能内胚层干细胞的方法及其应用
技术领域
[0001]本发明涉及生物技术和细胞领域。具体地，本发明涉及诱导分化细胞成多潜能内胚层干细胞的方法及其应用。
背景技术
[0002]细胞退分化(De-differentiation)特指分化细胞(differentiated cells)在某些外界条件刺激下失去其特有功能并返回上级发育阶段(earlier developmental stages)，是自然界中普遍存在的现象。退分化获得的前体/干细胞对组织损伤修复等有着重要意义。
[0003]hEnSCs在体外能够无限扩增并分化成功能性内胚层衍生细胞，但其生长依赖于小鼠成纤维细胞作为滋养层及高浓度的matrigel，限制了其临床应用。
[0004]原代肝实质细胞的退分化现象在其分离培养过程特别明显，许多功能性蛋白基因尤其是参与异物质代谢的一相酶P450家族，在培养的早期迅速丢失。关于人原代肝实质细胞的退分化机制目前尚未明了，然而由于人原代肝实质细胞不易获得、在体外不能长期培养、难以进行遗传操作，因此不适合用于退分化机制的研究。
[0005]因此，本领域迫切需要开发一种诱导分化细胞成多潜能内胚层干细胞(small molecule induced Endoderm Stem Cells，smEnSCs)的方法。
发明内容
[0006]本发明公开了一种诱导分化细胞成多潜能内胚层干细胞(small molecule induced Endoderm Stem Cells，smEnSCs)的方法。
[0007]本发明公开了一种利用小分子化合物及细胞因子组合诱导分化细胞成多潜能内胚层干细胞(small molecule induced Endoderm Stem Cells，smEnSCs)的方法
[0008]本发明还公开了，利用小分子首次在体外诱导分化细胞的退分化，并建立诱导多潜能内胚层干细胞系(smEnSCs)
[0009]本发明还公开了，通过优化培养方法，smEnSCs能够不依赖于滋养层细胞在体外无限扩增。
[0010]本发明还公开了，建立了smEnSCs在体外分化成肝实质细胞、胆管上皮细胞以及小肠上皮细胞等内胚层衍生细胞的分化体系。
[0011]在本发明第一方面，提供了一种诱导人类分化细胞分化为诱导多潜能内胚层干细胞(smEnSC)的方法，其特征在于，包括步骤：
[0012](a)在第一培养条件下，在培养体系中培养分化细胞，从而获得诱导多潜能内胚层干细胞(smEnSC)；其中，所述培养体系包括EGF、A83-01和CHIR99021。
[0013]在另一优选例中，所述分化为退分化。
[0014]在另一优选例中，所述第一培养条件含有第一培养基。
[0015]在另一优选例中，所述第一培养基选自下组：SFD、DMEM、DMEM/F12、或其组合。
磷酸镁(Ascorbic Acid Phosphate Magnesium)、L-谷氨酰胺(L-glutamine)、MTG、bFGF。[0017]在另一优选例中，所述分化细胞包括成体细胞。
[0018]在另一优选例中，所述成体细胞选自下组：肝实质细胞、胃上皮细胞、胰岛细胞、小肠上皮细胞、或其组合。
[0019]在另一优选例中，所述肝实质细胞包括原代肝实质细胞、干细胞分化来源的肝实质细胞。
[0020]在另一优选例中，所述成体细胞来源于成体组织分离、干细胞(如内胚层干细胞、诱导多能干细胞)的体外定向分化。
[0021]在另一优选例中，所述的内胚层干细胞来源于人胚胎干细胞或人诱导多能干细胞。
[0022]在另一优选例中，所述多能干细胞选自下组：人胚胎干细胞系(如H9、Hes2)、人诱导多能干细胞系(如ZRZ-iPSCs、WT6iPSCs)、或其组合。
[0023]在另一优选例中，所述的内胚层干细胞选自下组：H9、Hes2、ZRZ-iPSC EnSC、WT6iPSC EnSC、或其组合。
[0024]在另一优选例中，所述方法还包括步骤(b)：将诱导多潜能内胚层干细胞(smEnSC)分化为内胚层衍生细胞。
[0025]在另一优选例中，所述内胚层衍生细胞包括肝实质细胞、胆管上皮细胞、小肠上皮细胞、胰岛β细胞、胃上皮细胞。
[0026]在另一优选例中，所述步骤(b)中不含有滋养层细胞。
[0027]在另一优选例中，所述步骤(b)中，包括：
[0028](b1)在第二培养条件下，在培养体系中培养诱导多潜能内胚层干细胞，从而获得肝实质细胞；或
[0029](b2)在第三培养条件下，在培养体系中培养诱导多潜能内胚层干细胞，从而获得胆管细胞；或
[0030](b3)在第四培养条件下，在培养体系中培养诱导多潜能内胚层干细胞，从而获得小肠细胞。
[0031]在另一优选例中，所述第二培养条件含有第二培养基。
[0032]在另一优选例中，所述第二培养基包括肝向特化培养基、肝向成熟培养基I和肝向成熟培养基II。
[0033]在另一优选例中，所述肝向特化培养基选自下组：SFD、DMEM/F12、DMEM、或其组合。[0034]在另一优选例中，所述肝向成熟培养基I选自下组：SFD、DMEM/F12、DMEM、或其组合。
[0035]在另一优选例中，所述肝向成熟培养基II选自下组：SFD、HCM、DMEM/F12、DMEM、或其组合。
[0036]在另一优选例中，所述肝向特化培养基还含有选自下组的一种或多种添加物：[0037]BMP4、FGF、A83-01、SB431542、IWP2、Dexamethasone、DMSO。
[0038]在另一优选例中，所述肝向成熟培养基I还包括选自下组的一种或多种添加物：[0039]HGF、地塞米松(Dexamethasone)、OSM、C-E、A83-01、EGFi、VK1。
HGF、Dexamethasone、OSM、C-E、A83-01、EGFi、VK1。
[0041]在另一优选例中，所述第三培养条件含有第三培养基。
[0042]在另一优选例中，所述第三培养基包括胆管特化培养基和胆管成熟培养基。[0043]在另一优选例中，所述第三培养基选自下组：SFD、DMEM/F12、DMEM、William’s E、或其组合。
[0044]在另一优选例中，所述第三培养条件还含有选自下组的一种或多种添加物：[0045]FGF10、HGF、TGFβ、EGF、Activin A、地塞米松(Dexamethasone)。
[0046]在另一优选例中，所述第四培养条件含有第四培养基。
[0047]在另一优选例中，所述第四培养基包括扩增培养基、后肠特化培养基、小肠成熟培养基I和小肠成熟培养基II。
[0048]在另一优选例中，所述第四培养基选自下组：SFD、DMEM/F12、DMEM、或其组合。[0049]在另一优选例中，所述第四培养条件还含有选自下组的一种或多种添加物：[0050]FGF4、EGF、A83-01、CHIR99321、Wnt3a、R-spondin、EGF、Noggin。
[0051]在另一优选例中，所述扩增培养基选自下组：SFD、DMEM/F12、DMEM、或其组合。[0052]在另一优选例中，所述后肠特化培养基选自下组：SFD、DMEM/F12、DMEM、或其组合。[0053]在另一优选例中，所述小肠成熟培养基I选自下组：SFD、DMEM/F12、DMEM、或其组合。
[0054]在另一优选例中，所述小肠成熟培养基II选自下组：SFD、DMEM/F12、DMEM、或其组合。
[0055]在另一优选例中，所述扩增培养基还包括选自下组的一种或多种添加物：[0056]FGF4、EGF、A83-01。
[0057]在另一优选例中，所述后肠特化培养基还包括选自下组的一种或多种添加物：[0058]FGF4、CHIR99321。
[0059]在另一优选例中，所述小肠成熟培养基I还包括选自下组的一种或多种添加物：[0060]FGF4、CHIR99321、EGF、Noggin。
[0061]在另一优选例中，所述小肠成熟培养基II还包括选自下组的一种或多种添加物：CHIR99321、EGF、Noggin。
[0062]在另一优选例中，在步骤(a)中，将成体细胞在第一培养条件下培养3-18天，较佳地，4-16天，更佳地，6-12天。
[0063]在另一优选例中，在步骤(b1)中，将诱导多潜能内胚层干细胞在第二培养条件下培养15-40天，较佳地，18-36天，更佳地，20-25天。
[0064]在另一优选例中，在步骤(b2)中，将诱导多潜能内胚层干细胞在第三培养条件下培养10-30天，较佳地，15-28天，更佳地，15-21天。
[0065]在另一优选例中，在步骤(b3)中，将诱导多潜能内胚层干细胞在第四培养条件下培养20-50天，较佳地，22-45天，更佳地，25-40天。
[0066]在另一优选例中，所述方法具有选自下组的一个或多个特征：
[0067](i)高诱导多潜能内胚层干细胞分化率，所述分化率为80-98.5％，较佳地，90-95％；
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