(19)中华人民共和国国家知识产权局
(12)发明专利申请
(10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请号 201610110684.X
(22)申请日 2016.02.29
(71)申请人 广西医科大学
地址 530021 广西壮族自治区南宁市双拥
路22号
(72)发明人 卢小玲 赵永祥
(74)专利代理机构 深圳市顺天达专利商标代理
有限公司 44217
代理人 郭伟刚 周娇娇
(51)Int.Cl.
C12N 15/115(2010.01)
C12N 15/11(2006.01)
G01N 33/53(2006.01)
A61K 31/711(2006.01)
A61P 35/00(2006.01)
C12N 15/10(2006.01)C12Q 1/68(2006.01)
(54)发明名称一种特异性结合CD3的核酸适配体及其筛选方法和应用(57)摘要本发明公开了一种特异性结合CD3的核酸适配体及其筛选方法和应用。本发明所提供的核酸适配体，为如下(a )或(b)：(a )序列表中序列1所示的单链DNA片段；(b)将序列表中序列1经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加后所得序列所示的单链DNA片段，且与(a)中所述单链DNA片段具有相同功能。以本发明所提供的核酸适配体与CD3分子结合为基础，可以进一步用于靶向T细胞的药物设计、制备药物或其他制品；该核酸适配体序列可作为靶向T细胞的分子探针。本发明为T细胞活化及肿瘤靶向诊断与提供新思路与新工具， 具有重要的临床价值。权利要求书2页 说明书12页 附图2页CN 107129988 A 2017.09.05
C N 107129988
A
1.一种特异性结合CD3的核酸适配体，其特征在于，为如下(a)或(b)：
(a)序列表中序列1所示的单链DNA片段；
(b)将序列表中序列1经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加后所得序列所示的单链DNA片段，且与(a)中所述单链DNA片段具有相同功能。
2.一种核酸探针，其特征在于，为如下(c)或(d)：
(c)序列表中序列1所示的单链DNA片段，且在3′或5′末端标记有荧光报告基团；
(b)将序列表中序列1经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加后所得序列所示的单链DNA片段，且与序列1所示的单链DNA片段具有相同功能，并在3′或5′末端标记有荧光报告基团。
3.一种试剂盒，其特征在于，含有权利要求1所述特异性结合CD3的核酸适配体或权利要求2所述核酸探
针。
4.权利要求1所述的特异性结合CD3的核酸适配体或权利要求2所述核酸探针或权利要求3所述的试剂盒在如下(a1)-(a4)任一中的应用：
(a1)鉴定或辅助鉴定CD3；
(a2)制备鉴定或辅助鉴定CD3的产品；
(a3)检测待测物质中CD3浓度；
(a4)分离和/或富集CD3。
5.权利要求1所述的特异性结合CD3的核酸适配体在特异性结合CD3领域的应用。
6.根据权利要求5所示的应用，其特征在于，所述特异性结合CD3的核酸适配体在如下(b1)-(b2)任一中的应用：
(b1)利用所示特异性结合CD3的核酸适配体及其衍生物激发T细胞活化的信号转导；
(b2)利用所述特异性结合CD3的核酸适配体及其衍生物阻断T细胞活化的信号转导。
7.根据权利要求5所示的应用，其特征在于，所述特异性结合CD3的核酸适配体在如下(c1)-(c4)任一种的应用：
(c1)制备用于检测CD3的分子探针；
(c2)制备以CD3分子作为靶点的靶向T细胞的药品或制剂；
(c3)制备以CD3分子作为靶点的促进T细胞活化的药品或制剂；
(c4)制备以CD3分子作为靶点的抑制T细胞活化的药品或制剂。
8.一种根据权利要求1所述特异性结合CD3的核酸适配体的筛选方法，其特征在于，包括如下步骤：
(1)以如下核酸文库为起始核酸文库：
5’-TCTCGGACGCGTGTGGTCGG-N45-CTCGCTGCCTGGCCCTAGAGT G-3’，其中N45表示45个连续的N，N为A、T、C或G；
(2)采用基于细胞的指数富集配基系统进化技术对步骤(1)得到的起始核酸文库进行多轮筛选，其中采用293T细胞进行反筛和采用293T-CD3细胞进行正筛；所述293T-CD3细胞为稳定表达CD3的293T细胞；
(3)从步骤(2)筛选后得到的筛选产物中分离获得特异性结合CD3的核酸适配体。
9.根据权利要求8所述的特异性结合CD3的核酸适配体的筛选方法，其特征在于，所述步骤(2)具体为：对步骤(1)得到的起始核酸文库进行15轮筛选，其中前两轮采用正筛，第3-
15轮中每轮顺次完成反筛和正筛；
所述反筛为：将上轮正筛产物的溶液加入到贴壁生长的293T细胞中，0～5℃孵育30～60min后，收集上清液，记为上清液1作为本轮反筛产物；
所述正筛为：将起始核酸文库或者本轮反筛产物加入到贴壁生长的293T-CD3细胞中，0～5℃孵育1～2h，洗涤后弃上清，收集细胞，95-100℃变性5-10min，离心后收集上清液，记为上清液2；以所述上清液2作为模板进行2次PCR扩增，并用链霉亲和素微球从第二次PCR产物中分离得到FITC标记的单链DNA序列作为本轮正筛产物。
10.根据权利要求9所述的特异性结合CD3的核酸适配体的筛选方法，其特征在于，所述步骤(2)在每轮筛选过程中逐步增加筛选压力，所述增加筛选压力通过以下方式实现：减少核酸文库的物质的量，减少正筛时293T-CD3细胞用量及核酸文库与正筛细胞的孵育时间，增加反筛时293T细胞用量及核酸文库与反筛细胞的孵育时间。
一种特异性结合CD3的核酸适配体及其筛选方法和应用
技术领域
[0001]本发明属于生物医药领域，更具体地说，涉及一种特异性结合CD3的核酸适配体及其筛选方法和应用。
背景技术
[0002]CD3是一种重要的白细胞分化抗原，几乎在所有T细胞表面均存在。CD3抗原由6条肽链组成，常与TCR紧密结合形成含有8条肽链的TCR-CD3复合体。其通过盐桥与T细胞抗原受体(T cell receptor，TCR)相连，参与T细胞的信号转导，主要用于标记胸腺细胞、T淋巴细胞及T细胞淋巴瘤。T淋巴细胞介导的细胞免疫是机体抗肿瘤免疫的主要机制，T细胞经特异抗原刺激后，TCR特异性识别结合抗原呈递细胞(APC)表面MHC-Ⅱ类分子/抗原肽，产生第一信号；T细胞与APC表面多对共刺激分子(如CD28、CTLA-4和CD80、CD86等)相互作用产生T 细胞活化的第二信号，并分泌IL-2、TNF-α、TNF-β、IFN-γ和IL-4等多种细胞因子，产生特异性的细胞毒作用，发挥抗肿瘤效应。
[0003]核酸适配体(aptamer)是一类通过指数富集配体系统进化技术(Systematic evolution of ligands by exponential enrichment，SELEX)从大容量的核酸文库中筛选获得能与靶分子高特异性高亲和力结合的
单链DNA或RNA序列，因其类似于抗体的高亲和力而被称为“化学抗体”。适配体有许多独特的优势，如靶分子范围广泛、无免疫原性、分子量小、稳定性好等。这些特性使它在识别靶标时相较抗体或其他类型配体有较大的优势。[0004]近来，越来越多的研究使用Cell-SELEX技术筛选出具有较好的亲和力和特异性的核酸适配体，并进一步探究其功能。目前有部分适配体已用于肿瘤相关的诊治当中，适配体在肿瘤靶向诊断及方面具有十分广泛的应用前景。
[0005]然而，目前缺少以CD3分子为靶标能够有效特异性结合T细胞的核酸适配体。
发明内容
[0006]针对以上现状，本发明提供了一种特异性结合CD3的核酸适配体及其筛选方法和应用。
[0007]本发明所提供的特异性结合CD3的核酸适配体，具体为如下(a)或(b)：
[0008](a)序列表中序列1所示的单链DNA片段；
[0009](b)将序列表中序列1经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加后所得序列所示的单链DNA片段，且与(a)中所述单链DNA片段具有相同功能。
[0010]将所述单链DNA片段进行修饰或改造得到的核酸适配体衍生物也属于本发明的保护范围。
[0011]所述核酸适配体衍生物可为如下任意一种：
[0012]1)将所述核酸适配体删除部分或增加部分核苷酸，得到与所述核酸适配体具有相同功能的核酸适配体衍生物；
[0013]2)将所述核酸适配体进行核苷酸取代或部分修饰，得到与所述核酸适配体具有相
同功能的核酸适配体衍生物；
[0014]3)将所述核酸适配体的骨架改造为硫代磷酸脂骨架，得到与所述核酸适配体具有相同功能的核酸适配体衍生物；
[0015]4)将所述核酸适配体改为肽核酸，得到与所述核酸适配体具有相同功能的核酸适配体衍生物；
[0016]5)将所述核酸适配体的任一端或中间或两端接上信号分子(如荧光素FITC、FAM、罗丹明B、或放射性分子)、活性分子(如生物素、氨基、羧基、酶)或其它功能基团后，得到与所述核酸适配体具有相同功能的核酸适配体衍生物。
[0017]本发明还提供一种核酸探针。
[0018]本发明所提供的核酸探针，具体为如下(c)或(d)：
[0019](c)序列表中序列1所示的单链DNA片段，且在3’或5′末端标记有荧光报告基团；[0020](d)将序列表中序列1经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加后所得序列所示的单链DNA片段，且与序列1所示的单链DNA片段具有相同功能，并在3’或5′末端标记有荧光报告基团。其中，所述荧光报告基团具体可为异硫氰酸荧光素(FITC)、罗丹明B、羧基荧光素(FAM)(如6-FAM)、四甲基罗丹明(TAMRA)、Cy3或Cy5。
[0021]含有所述特异性结合CD3的核酸适配体或所述核酸探针的试剂盒也属于本发明的保护范围。
[0022]所述特异性结合CD3的核酸适配体或所述核酸探针或所述试剂盒在如下(a1)-(a4)任一中的应用也属于本发明的保护范围：
[0023](a1)鉴定或辅助鉴定CD3；
[0024](a2)制备鉴定或辅助鉴定CD3的产品；
[0025](a3)检测待测物质中CD3的浓度；
[0026](a4)分离和/或富集CD3。
[0027]其中，(a1)所述的鉴定或辅助鉴定CD3具体可为检测待测物质是否为或候选为CD3、检测待测物质是否含有或候选含有CD3等。
[0028]本发明还保护了特异性结合CD3的核酸适配体在特异性结合CD3领域的应用。[0029]其中，所述特异性结合CD3核酸适配体在如下(b1)-(b2)任一中的应用也属于本发明的保护范围：
[0030](b1)利用上述(a)或(b)及其衍生物激发T细胞活化的信号转导。
[0031](b2)利用上述(a)或(b)及其衍生物阻断T细胞活化的信号转导。
[0032]所述特异性结合CD3核酸适配体在如下(c1)-(c4)任一中的应用也属于本发明的保护范围：
[0033](c1)制备用于检测CD3的分子探针；
[0034](c2)制备以CD3分子作为靶点的靶向T细胞的药品或制剂；
[0035](c3)制备以CD3分子作为靶点的促进T细胞活化的药品或制剂。
[0036](c4)制备以CD3分子作为靶点的抑制T细胞活化的药品或制剂。
[0037]本发明还提供一种如上所述的特异性结合CD3的核酸适配体的筛选方法。[0038]本发明所提供的特异性结合CD3的核酸适配体的筛选方法，具体可包括如下步骤：[0039](1)以如下核酸文库为起始核酸文库：
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