(10)申请公布号 (43)申请公布日 2014.10.15
C N 104099351
A (21)申请号 201410336949.9
(22)申请日 2014.07.15
C12N 15/53(2006.01)
C12N 9/02(2006.01)
C12N 15/63(2006.01)
(71)申请人大连理工大学
地址116024 辽宁省大连市高新园区凌工路
2号
(72)发明人杨君 白敬 刘培瑜 姜熙 杨青
(74)专利代理机构大连东方专利代理有限责任
公司 21212
代理人贾汉生 李馨
(54)发明名称
用
(57)摘要
本发明公开了一种突变型细菌硝基还原酶基
因及其应用，属于酶工程领域。基于蛋白质三维结
构及分子对接，发现大肠杆菌硝基还原酶NfsB 中
第124位苯丙氨酸通过与多硝基底物的侧链基团
相互作用，从而影响底物在活性口袋中的定位。突
变体F124W 、N71S/F124W 、F123A/F124W 和N71S/
F123A/F124W 可催化癌症前药CB1954专一性
生成具有高生物毒性的4-NHOH 产物。同时这些突
变体较野生型酶相比催化活性提高了7-24倍，以
N71S/F123A/F124W 表现最为显著。本发明所提供
的具有专一还原选择性的硝基还原酶突变体在癌
症及其他疾病方面具有良好的应用前景。
(51)Int.Cl.
权利要求书1页 说明书8页
序列表5页 附图1页
(19)中华人民共和国国家知识产权局(12)发明专利申请
权利要求书1页 说明书8页序列表5页 附图1页(10)申请公布号CN 104099351 A
1.一类区位选择性细菌硝基还原酶基因，其核苷酸序列为SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4中的一种。
2.如权利要求1所述的区位选择性细菌硝基还原酶基因所编码的蛋白质，其氨基酸序列为SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:8中的一种。
3.一种包含如权利要求1所述基因之一的重组表达载体。
4.一种包含如权利要求3所述的重组表达载体之一的重组表达转化体。
5.一种重组区位选择性细菌硝基还原酶的制备方法，其特征在于：培养权利要求4所述重组表达转化体之一的菌株，从菌株的培养物中纯化得到突变型区位选择性细菌硝基还原酶的蛋白。
6.如权利要求2所述的蛋白质或如权利要求4所述的重组表达转化体作为催化剂在催化硝基还原，在药物激活剂代谢、芳香羟胺化合物的生物合成以及硝基类环境污染物生物代谢领域的应用。
一种区位选择性细菌硝基还原酶基因及其应用
技术领域
[0001] 本发明属于酶工程领域，具体涉及一种突变型硝基还原酶的基因，以及含有该基因的重组酶，及其在硝基区位选择性还原中的应用。
背景技术
[0002] 硝基还原酶是一类依赖于FMN或FAD的细胞质酶，可利用NAD(P)H催化硝基基团还原，经亚硝基中间产物最终生成羟氨或氨基产物。硝基基团作为生物医药、抗菌剂和杀虫剂中常见的官能基团，它的还原是实现药物生物和体内降解代谢的关键步骤，在此过程中硝基还原酶起到了关键性的作用。其中大肠杆菌硝基还原酶NfsB与癌症前药5-(1-氮丙啶)-2，4-二硝基苯甲酰胺(CB1954)组成的激活系统目前已进入临床III期实验阶段。NfsB可在体内将CB1954转化成为强细胞毒性的DNA交联剂，能够同时杀死增殖期和休眠期的癌细胞。最近完成的I/II期实验表明，若在癌症病人体内利用复制缺陷型载体表达NfsB，随后注射前药CB1954可显著缓解病情。然而体内催化效果较差成为抑制其广泛应用的主要因素，而造成这一结果的原因之一则是NfsB对CB1954硝基的还原缺乏区位选择性。[0003] 以往研究发现，CB1954的两种羟氨产物(2-NHOH和4-NHOH)对癌细胞的生物毒性不同，其中4-NHOH产物具有更显著的生物毒性。而大肠杆菌硝基还原酶NfsB在催化CB1954时，等比例生成2-NHOH产物和4-NHOH产物，在一定程度上影响了NfsB对CB1954的体内激活活性。若能通过对酶分子的改造，使其选择性生成4-NHOH产物，可能将有利于该系统体内活性的提高。
[0004] 因此，寻开发高效的具有专一还原选择性的硝基还原酶在癌症及其他疾病的方面具有显著的商业价值和应用前景。
发明内容
[0005] 为获得专一区位选择性的硝基还原酶，本发明通过蛋白质结构及分子对接模拟分析，发现124的氨基酸残基通过与底物侧链基团的相互作用从而影响底物在活性中心的定位。若将124位的苯丙氨酸(Phe)突变为氨酸(Trp)(简写为F124W)，可显著改变酶的区域选择性。与野生型硝基还原酶相比，突变体NfsB-F124W可还原癌症前药CB1954生成单一的较高生物毒性的4-NHOH产物。同时对其他可能影响酶催化活性的氨基酸进行了组合突变，将71位的天冬酰胺(Asn)突变为丝氨酸(Ser)(简写为N71S)，将123位的苯丙氨酸(Phe)突变为丙氨酸(Ala)(简写为F123A)，获得相应的组合突变体分别为NfsB-N71S/ F124W、NfsB-F123A/F124W和NfsB-N71S/F123A/F124W，这些突变体在保持专一区位选择性的基础上均进一步提高了对CB1954的催化活性，其中NfsB-N71S/F123A/F124W表现最为显著，还原活性较野生型提高了24倍。目前硝基还原酶的生理底物和催化机制尚不明确，尤其是针对于外源的硝基芳香化合物而言，无法确定该底物在酶活性口袋内的正确定位，从而很难确定与侧链基团相互作用的关键氨基酸及该氨基酸是如何影响底物在活性口袋内的定位。此外，底物在酶活性口袋内定位通常受到多个氨基酸的共同作用，很难确定其中哪
个或哪几个氨基酸发挥主要的作用。同时对这些位点的突变具有很高的风险性和不确定性，虽然在一定程度上实现了区位选择性的改变，但可能引起酶催化活性的降低甚至丧失。针对以上问题，本发明采用分子对接模拟的手段考察了候选氨基酸位点可能的作用，并在此基础上进行单点突变，进一步将有益突变位点进行组合突变，考察其对选择性实现及活性提高的协同作用。
[0006] 本发明具体涉及四种突变型硝基还原酶的基因，以及含有该基因的重组表达载体和重组表达转化体，其重组酶和该重组酶的制备方法，以及该突变型硝基还原酶或含有该突变型基因重组表达转化体作为催化剂在药物激活及代谢、芳香羟氨生物合成和硝基污染物生物降解等领域中的应用。
[0007] 本发明的一方面在于提供一类区位选择性细菌硝基还原酶基因，分别命名为硝基还原酶单突变体NfsB-F124W，以及三种组合突变体NfsB-N71S/F124W、NfsB-F123A/F124W 和NfsB-N71S/F123A/F124W，其核苷酸序列分别如SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4所示。
[0008] 本发明的另一目的是提供上述区位选择性细菌硝基还原酶基因所编码的蛋白质，具有SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:8所示的氨基酸序列。[0009] 本发明的另一目的是提供含有上述区位选择性细菌硝基还原酶基因之一的重组表达载体，或其重组表达转化体。以及编码上述区位选择性细菌硝基还原酶DNA的基因工程菌或转基因细胞系。
[0010] 本发明的另一目的是提供一种区位选择性细菌硝基还原酶的制备方法，其步骤包括：培养上述含有该区位选择性细菌硝基还原酶基因之一的重组表达转化体，分别从培养物中纯化得到相应的突变型区位选择性细菌硝基还原酶基因。
[0011] 上文所述的制备方法，其更具体的技术方案如下：根据大肠杆菌(Escherichia coli)硝基还原酶NfsB基因NCBI编码：NC_000913，设计定点突变的突变引物，以携带硝基还原酶基因的克隆载体为模板进行定点突变构建突变体；以pET-28a(+)或能表达该酶的载体为表达载体，将重组质粒转化到大肠杆菌BL21(DE3)细胞或能表达该酶的宿主细胞，挑选验证后的阳性单克隆进行发酵培养。经融合表达纯化得到突变型硝基还原酶蛋白。[0012] 本发明的另一目的是提供上述技术方案中所述的各个区位选择性细菌硝基还原酶基因编码的蛋白或重组表达转化体，或者其各自作为催化剂在催化硝基还原，在药物激活剂代谢、芳香羟胺化合物的生物合成以及硝基类环境污染物生物代谢等领域的应用。其中，组合突变体NfsB-N71S/F123A/F124W可还原癌症前药CB1954生成单一的较高生物毒性的4-NHOH产物，其还原活性较野生型提高了24倍。
附图说明
[0013] 图1.HPLC分析NfsB野生型及突变体蛋白对癌症前药CB1954还原的区域选择性。由图中所示内容可知，单突变体NfsB-F124W和组合突变体NfsB-N71S/F124W、NfsB-F123A/F124W和NfsB-N71S/
F123A/F124W均专一性还原CB1954的4位硝基，生成高生物毒性的4NHOH产物。此外，在相同反应条件、反应时间内突变体可实现CB1954的完全转化，而野生型催化的反应混合物中仍有底物CB1954剩余。这些突变体在具有4位硝基专一选择性之外，对CB1954的催化活性较野生型也均有显著的提高。因此，突变体NfsB-F124W、
NfsB-N71S/F124W、NfsB-F123A/F124W和NfsB-N71S/F123A/F124W可替代野生型蛋白应用于CB1954前药激活系统中，有利于提高该系统在体内对CB1954的催化活性。
具体实施方式
[0014] 下述非限定性实施例可以使本领域的普通技术人员更全面地理解本发明，但不以任何方式限制本发明。
[0015] 本发明中设计使用的重叠延伸PCR引物序列：
[0016] nfsB-WT-F：5’-GGAATTCCATATGGATATCATTTCTGTCGCCTTAAAG-3’；SEQ ID NO:9；[0017] nfsB-WT-R：5’-GGAATTCTTACACTTCGGTTAAGGTGATGTT-3’；SEQ ID NO:10；[0018] nfsB-N71S-F：5’-ATGTGTTCAGCGAACGTAAAATGCTTGATG-3’；SEQ ID NO:11；[0019] nfsB-N71S-R：5’-ATTTTACGTTCGCTGAACACATAATTACCGGCAG-3’SEQ ID NO:12；[0020] nfsB-F124
W-F：5’-TCGCAAGTTCTGGGCTGATATGCACCGTAAAGATC-3’；SEQ ID NO:13；[0021] nfsB-F124W-R：5’-TATCAGCCCAGAACTTGCGACCTTTATCGTTCG-3’；SEQ ID NO:14；[0022] nfsB-F123A/F124W-F：5’-TCGCAAGGCCTGGGCTGATATGCACCGTAAAGATC-3’；SEQ ID NO:15；
[0023] nfsB-F123A/F124W-R：5’-TATCAGCCCAGGCCTTGCGACCTTTATCGTTCG-3’；SEQ ID NO:16；
[0024] 实施例1突变型硝基还原酶F124W、N71S/F124W、F123A/F124W和N71S/F123A/ F124W的基因获取及表达载体构建
[0025] 1.野生型nfsB基因的克隆与克隆载体构建
[0026] 根据NCBI提供的E.coli K12菌株(Invitrogen)中nfsB基因序列，设计引物(nfsB-WT-F：5’-GGAATTCCATATGGATATCATTTCTGTCGCCTTAAAG-3’，nfsB-WT-R：5’-GGAATT CTTACACTTCGGTTAAGGTGATGTT-3’)，其中下划线部分表示酶切位点对应的基因序列。利用提取的E.coli K12基因组DNA为模版，进行PCR扩增。取10μl PCR反应产物跑琼脂糖凝胶电泳验证，电泳条带约650bp与nfsB基因大小一致。使用TaKaRa Agarose Gel DNA Purification Kit Ver.3.0切胶回收上述电泳目的条带，然后用EcoR I/Nde I双酶切处理回收产物，使用TaKaRa DNA Fragment Purification Kit Ver.3.0将其纯化，之后使用DNA Ligation Kit Ver.3.0中的连接酶，将纯化后得到的目的产物与经EcoR I/
Nde I双酶切处理的pET28a(+)空载体连接后，热激转化至E.coli DH5α感受态细胞中，涂布平板，37℃过夜培养。挑选阳性菌落过夜37℃培养后提取质粒并送TaKaRa测序确认与nfsB基因(Gene ID:945778)序列一致，验证基因克隆成功，并将其命名为野生型nfsB基因，并将其对应的阳性菌落和重组质粒分别命名为克隆菌E.coli DH5α-nfsB-WT和质粒pET28a-nfsB-WT。[0027] 2.突变型NfsB-F124W的基因获取及表达载体构建
[0028] 过夜培养E.coli DH5α-nfsB-WT克隆菌，提取pET28a-nfsB-WT重组质粒，以此为模板构建突变体载体pET28a-nfsB-F124W。
[0029] 首先以质粒pET28a-nfsB-WT为模板，使用引物nfsB-WT-F和nfsB-F124W-R：5’-T ATCAGCCCAGAACTTGCGACCTTTATCGTTCG-3’进行一次PCR反应，命名为nfsB-F124W-1。同样以质粒pET28a-nfsB-WT为模板，使用引物nfsB-WT-R和nfsB-F124W-F：5’-TCGCAAGT TCTGGGCTGATATGCACCGTAAAGATC-3’进行二次PCR反应，命名为nfsB-F124W-2。其中引物
豫公网安备41160202000603
站长QQ:729038198
关于我们
投诉建议