(19)中华人民共和国国家知识产权局
(12)发明专利申请
(10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请号 201610821210.6
(22)申请日 2016.08.31
(71)申请人 泰山医学院
地址 271000 山东省泰安市迎胜东路2号
(72)发明人 张忠 张瑞玲 庄桂芬 黄振东
薛志静 李研
(51)Int.Cl.
C12Q 1/18(2006.01)
C12R 1/385(2006.01)
C12R 1/44(2006.01)
C12R 1/05(2006.01)
C12R 1/01(2006.01)
C12R 1/19(2006.01)
C12R 1/645(2006.01)
(54)发明名称
(57)摘要
本发明公开了一种高通量快速筛选真菌拮
抗菌的方法，该方法包括在48孔细胞培养板各孔
内加入3-5％冷却凝固的琼脂，然后加入2-10μl 待测菌培养液，待其渗入铺底的琼脂之后，再在
其上等量加入10-20μl冷却而未凝固的琼脂并
均匀覆盖于细菌表面，待其冷却凝固，细胞培养
板的各个孔中形成对应细菌的琼脂基质，然后再
加入真菌孢子，于6h、12h或24h，观察、计数细胞 著低于阴性对照和空白对照孔内的细菌既为抑
制菌的候选细菌。该方法与传统的对峙实验或玻
片法孢子抑制实验相比，不再对待测菌进行单一
逐个实验，而是将多种待测菌同时放入多孔细胞
培养板同时进行实验，大大缩短了试验周期且容
易观察和比对，实现了高通量快速筛选真菌拮抗
菌。权利要求书1页 说明书4页 附图2页CN 106566870 A 2017.04.19
C N 106566870
A
1.一种高通量快速筛选真菌拮抗菌的方法，包括以下步骤：
一、收集目标真菌的孢子；
二、准备待测菌培养液和LB菌培养液：各待测菌均在液体培养基内培养过夜；
三、取琼脂糖30-50mg置于50ml烧杯中，加入1ml水，100℃水浴加热10min，使琼脂融化，往细胞培养板的各个孔内等量加入100-200μl融化琼脂，让其铺底并冷却凝固；
四、在细胞培养板各孔内并在冷却凝固的琼脂的上方等量加入2-10μl步骤二中准备的各种待测菌培养液，以加入等量LB菌培养液的孔作为空白对照，加入等量大肠杆菌标准菌株的孔作为阴性对照，待其渗入铺底的琼脂之后，再在其上等量加入10-20μl冷却而未凝固的琼脂并均匀覆盖于细菌表面，待其冷却凝固，细胞培养板的各个孔中形成对应细菌的琼脂基质；
五、在步骤四中每一琼脂基质上等量加入步骤一中收集的孢子，使其粘附在琼脂基质上，加盖细胞培养板盖子，将其放入底部带有浸湿纱布的塑料盒内，加盖后，并将该塑料盒放入27-30℃培养箱内进行保湿培养；
六、分别于培养后6h、12h或24h，观察、计数细胞培养板各孔内孢子的萌发率。其中孢子萌发率显著低于阴性对照和空白对照孔内的细菌既为抑制菌的候选细菌。
2.根据权利要求1所述的一种高通量快速筛选真菌拮抗菌的方法，其特征在于：所述真菌孢子取自植物病原真菌、环境污染真菌、食品污染真菌或饲料污染真菌的孢子，所述细胞培养板设置为48孔。
权 利 要 求 书1/1页CN 106566870 A
一种高通量快速筛选真菌拮抗细菌的方法
技术领域
[0001]本发明涉及真菌拮抗细菌筛选领域，具体为一种高通量快速筛选真菌拮抗菌的方法。
背景技术
[0002]真菌大致分为植物病原真菌、动物致病真菌、环境污染真菌和食品污染真菌等几类。对于动物致病真菌，该种真菌在动物体内或体表滋生，在体外难以培养，因此对其拮抗菌的研究较少；而对于植物病原真菌、环境污染真菌和食品污染真菌，其生活环境相对开放，孢子可大量释放于环境中，该类孢子便于收集，因此现实中研究植物病原真菌、环境污染真菌或食品污染真菌的拮抗菌的较多。
[0003]拮抗菌的筛选主要有有平板对峙培养法、滤纸片法、打孔法、摇菌法等，上述方法虽然操作简单且便于观察，但由于部分真菌的生长缓慢，因此实验周期都较长，不利于拮抗菌的快速筛选，且该实验过程受外界环境影响较大，从而制约着拮抗菌的筛选。
[0004]由于大部分真菌均通过孢子进行传播，而孢子的萌发是真菌是否能生长、定殖、入侵的先决条件，因此可通过研究物质对真菌孢子的萌发是否有抑制作用，来快速判断其是否有抗真菌的潜力，而传统的真菌孢子萌发抑制实验以凹玻片法、琼脂法等为主，但一个玻片只能处理一个样品，当需要从多种类别的菌类中寻拮抗菌时，该单一处理方式需要连续重复进行，效率低且费时费力，无法满足高通量快速筛选的要求。
发明内容
[0005]本发明针对以上不足之处，提供一种高通量快速筛选真菌拮抗细菌的方法，该方法不再对待测菌进行单一逐个实验，而是将多种待测菌同时放入多孔细胞培养板同时进行实验，大大缩短了试验周期且容易观察和比对，实现了高通量快速筛选真菌拮抗细菌。[0006]本发明解决其技术问题所采用的技术方案是：本发明包括以下步骤：
[0007]一、收集目标真菌的孢子；
[0008]二、准备待测菌培养液和LB菌培养液：各待测菌均在液体培养基内培养过夜；[0009]三、取琼脂糖30-50mg置于50ml烧杯中，加入1ml水，100℃水浴加热10min，使琼脂融化，往细胞培养板的各个孔内等量加入100-200μl融化琼脂，让其铺底并冷却凝固；[0010]四、在细胞培养板各孔内并在冷却凝固的琼脂的上方等量加入2-10μl步骤二中准备的各种待测菌培养液，以加入等量LB培养液的孔作为空白对照，加入等量大肠杆菌标准菌株的孔作为阴性对照，待其渗入铺底的琼脂之后，再在其上等量加入10-20μl冷却而未凝固的琼脂并均匀覆盖于细菌表面，待其冷却凝固，细胞培养板的各个孔中形成对应细菌的琼脂基质；
[0011]五、在步骤四中每一琼脂基质上等量加入步骤一中收集的孢子，使其粘附在琼脂基质上，加盖细胞培养板盖子，将其放入底部带有浸湿纱布的塑料盒内，加盖后，并将该塑料盒放入27-30℃培养箱内进行保湿培养；
[0012]六、分别于培养后6h、12h或24h，观察、计数细胞培养板各孔内孢子的萌发率。其中孢子萌发率显著低于阴性对照和空白对照孔内的细菌既为抑制菌的候选细菌。
[0013]本方法通过使用细胞培养板实现了多种待测菌同时进行孢子的萌发，不再单一逐个进行，大大缩短了实验周期；同时进行比对与观察，节约了实验器材且省时省力；采用该方法只对孢子的萌发进行观测和计算萌发率就能出拮抗菌，不再通过传统的方法等待细菌的完全成长，实验周期短且便于实验的重复进行。
[0014]本方法与传统琼脂培养法相比，成本低廉，可一次性处理几十个样品；与液体培养法相比，孢子位置相对固定，且不聚集成团，有利于持续观察和拍照。该方法可作为平板对峙实验测定抑制真菌生长细菌的候选菌株的快速筛选。既可用于同一种真菌的多种细菌的筛选，也可用于同一细菌对不同真菌的拮抗作用，还可用于多种细菌对不同真菌的拮抗筛选。
[0015]本发明设计了，所述真菌孢子取自植物病原真菌、环境污染真菌、食品污染真菌或饲料污染真菌的孢子，所述细胞培养板设置为48孔。
附图说明
[0016]图1所示为球孢白僵菌孢子在含不同细菌培养基质上的萌发率实验设计图；[0017]图2所示实施例1中各个待测菌对应的萌发率表；
[0018]图3所示实施例2中各个待测菌对应的萌发率表；
[0019]图4所示实施例3中各个待测菌对应的萌发率表；
[0020]图5所示为实施例4的实验示意图。
具体实施方式
[0021]取球孢白僵菌Beauveria bassiana孢子涂布于PDA培养基上，温度为30℃，湿度为75％，培养4d，待其产生孢子并收集，以供下述各实施例使用；下述各实施例的待测菌为：从家蝇体内分离到的铜绿假单胞菌Pseudomonas aeruginosa、普罗威登斯菌Providencia sp.、葡萄球菌Staphylococcus sp.、博德特氏菌Bordetella sp.、粪产碱菌Alcaligenes faecalis、柠檬酸杆菌Citro ba cter s p.、肠球菌Enterococcus s p.、土壤杆菌Agrobacterium sp.、白杆菌Leucobacter sp.、拉乌尔菌属Raoultella sp.、鞘氨醇杆菌Sphingobacterium sp.和乳球菌Lactococcus sp.等12种细菌和大肠杆菌。
[0022]实施例1：
[0023]一种高通量快速筛选真菌拮抗菌的方法，包括以下步骤：
[0024]一、收集目标真菌的孢子；
[0025]二、准备待测菌培养液和LB菌培养液：各待测菌均在液体培养基内培养过夜；[0026]三、取琼脂糖30mg置于50ml烧杯中，加入1ml水，100℃水浴加热10min，使琼脂融化，往细胞培养板的各个孔内等量加入100μl融化琼脂，让其铺底并冷却凝固；
[0027]四、在细胞培养板各孔内并在冷却凝固的琼脂的上方等量加入2μl步骤二中准备的各种待测菌培养液，以加入等量LB培养液的孔作为空白对照，加入等量大肠杆菌标准菌株的孔作为阴性对照，待其渗入
铺底的琼脂之后，再在其上等量加入10μl冷却而未凝固的琼脂并均匀覆盖于细菌表面，待其冷却凝固，细胞培养板的各个孔中形成对应细菌的琼脂
基质；
[0028]五、在步骤四中每一琼脂基质上等量加入步骤一中收集的孢子，使其粘附在琼脂基质上，然后加入8μl无菌水并加盖细胞培养板盖子，将其放入底部带有浸湿纱布的塑料盒内，加盖并将该塑料盒放入27℃培养箱内进行保湿培养；
[0029]六、分别于培养后12h，观察、计数细胞培养板各孔内孢子数并计算萌发率，并以含有LB细菌的的琼脂基质的孔作为空白对照。
[0030]如图1所示为48孔的细胞培养板，其中LB细菌培养基空白对照区1、待测菌区2、大肠杆菌区3，其中加LB培养基的空白对照占6个孔，大肠杆菌为阴性对照的占6个孔，其余待测菌的12种细菌各占3孔)；
[0031]图2所示为各个待测菌对应的萌发率表，通过该表可以看出，在家蝇体内分离到的12种细菌中仅铜绿假单胞菌和粪产碱菌对球孢白僵菌孢子萌发有明显抑制作用，其孢子萌发率分别为7％和15％，显著低于其余10种细菌及大肠杆菌的阴性对照。而其余10种细菌与大肠杆菌的阴性对照和LB培养基的空白对照相比均无显著差异，球孢白僵菌孢子萌发率均达80％以上。同时，铜绿假单胞菌对球孢白僵菌孢
子萌发的抑制作用显著高于粪产碱菌。说明在家蝇体内仅铜绿假单胞菌和粪产碱菌有抑制球孢白僵菌孢子萌发的作用，且铜绿假单胞菌的抑制作用更强；
[0032]实施例2：
[0033]一种高通量快速筛选真菌拮抗菌的方法，包括以下步骤：
[0034]一、收集目标真菌的孢子；
[0035]二、准备待测菌培养液和LB菌培养液：各待测菌均在液体培养基内培养过夜；[0036]三、取琼脂糖50mg置于50ml烧杯中，加入1ml水，100℃水浴加热10min，使琼脂融化，往细胞培养板的各个孔内等量加入200μl融化琼脂，让其铺底并冷却凝固；
[0037]四、在细胞培养板各孔内并在冷却凝固的琼脂的上方等量加入10μl步骤二中准备的各种待测菌培养液，以加入等量LB培养液的孔作为空白对照，加入等量大肠杆菌标准菌株的孔作为阴性对照，待其渗入铺底的琼脂之后，再在其上等量加入20μl冷却而未凝固的琼脂并均匀覆盖于细菌表面，待其冷却凝固，细胞培养板的各个孔中形成对应细菌的琼脂基质；
[0038]五、在步骤四中每一琼脂基质上等量加入步骤一中收集的孢子，使其粘附在琼脂基质上，然后加入12μl无菌水并加盖细胞培养板盖子，将其放入底部带有浸湿纱布的塑料盒内，加盖并将该塑料盒放入
27℃培养箱内进行保湿培养；
[0039]六、分别于培养后6h，观察、计数细胞培养板各孔内孢子数并计算萌发率，并以含有LB细菌的的琼脂基质的孔作为空白对照。
[0040]本实施例与上述两个实施例都是采用48孔的细胞培养板，其实验设计图也一样，图3所示为各个待测菌对应的萌发率表，通过该图可以看出，在家蝇体内分离到的12种细菌中仅铜绿假单胞菌和粪产碱菌对球孢白僵菌孢子萌发有明显抑制作用，其孢子萌发率分别为17％和30％，显著低于其余10种细菌及大肠杆菌的阴性对照。而其余10种细菌与大肠杆菌的阴性对照和LB培养基的空白对照相比均无显著差异，球孢白僵菌孢子萌发率均达83％左右。同时，铜绿假单胞菌对球孢白僵菌孢子萌发的抑制作用显著高于粪产碱菌。说明在家蝇体内仅铜绿假单胞菌和粪产碱菌有抑制球孢白僵菌孢子萌发的作用，且铜绿
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