(19)中华人民共和国国家知识产权局
(12)发明专利申请
(10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请号 201610547947.3
(22)申请日 2016.07.13
(83)生物保藏信息
CGMCC No ：12239 2016.04.13
(71)申请人 中国科学院青岛生物能源与过程研
究所
地址 266101 山东省青岛市崂山区松岭路
189号
(72)发明人 崔球 宋晓金 马增新 崔古贞
冯银刚
(74)专利代理机构 沈阳科苑专利商标代理有限
公司 21002
代理人 李颖 周秀梅
(51)Int.Cl.
C12N 1/12(2006.01)
C12P 7/64(2006.01)C12R 1/89(2006.01) (54)发明名称
(57)摘要
一种寇氏隐甲藻及利用其高密度发酵生产DHA的
方法。寇氏隐甲藻，其分类命名为寇氏隐甲藻
(Crypthecodinium cohnii)SD401，已于2016年
04月13日保藏于位于北京市朝阳区北辰西路1号
院3号的中国微生物菌种保藏管理委员会普通微
生物中心(CGMCC )，其保藏编号为CGMCC No ：
12239。本发明所得菌株生长速度快，利用该寇氏
隐甲藻菌株发酵生产二十二碳六烯酸。在上述发
酵条件下，90-120小时即能获得最大产量。经发
酵后获得生物量为90-130g/L ，DHA产量为23-
35g/L。权利要求书1页 说明书5页 附图1页CN 106010970 A 2016.10.12
C N 106010970
A
1.一种寇氏隐甲藻，其特征在于：寇氏隐甲藻，其分类命名为寇氏隐甲藻(Crypthecodinium cohnii)SD401，已于2016年04月13日保藏于位于北京市朝阳区北辰西路1号院3号的中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC )，其保藏编号为CGMCC No：12239。
2.一种权利要求1所述的寇氏隐甲藻的应用，其特征在于：所述寇氏隐甲藻在制备二十二碳六烯酸中的应用。
3.按权利要求2所述的寇氏隐甲藻的应用，其特征在于：以所述寇氏隐甲藻为出发菌株，在发酵培养基中发酵获得DHA油脂。 4.按权利要求3所述的寇氏隐甲藻的应用，其特征在于：所述发酵温度为30℃-35℃，发酵时间为90-120小时，发酵过程中，采用了补氮操作，在发酵的30-80小时区间内流加50％(w/v)的玉米浆溶液。 5.按权利要求3所述的寇氏隐甲藻的应用，其特征在于：所述发酵培养基为葡萄糖30-80g/L，酵母提取物5-20g/L，玉米浆5-20g/L，磷酸二氢钾0.5-8g/L，硫酸镁0.5-3g/L，柠檬酸钠0.5-3g/L，海水晶5-30g/L，维生素B 1 30-200mg/L，维生素B 630-200mg/L，维生素B 12 5-50mg/L和生物素2-50mg/L。
6.一种生产DHA油脂的方法，其特征在于：以寇氏隐甲藻寇氏隐甲藻为出发菌株，在发酵培养基中发酵获得D H A 油脂；所述寇氏隐甲藻，其分类命名为寇氏隐甲藻(Crypthecodinium cohnii)SD401，已于2016年04月13日保藏于位于北京市朝阳区北辰西路1号院3号的中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC )，其保藏编号为CGMCC No：12239。
7.按权利要求6所述的生产DHA油脂的方法，其特征在于：所述发酵温度为30℃-35℃，发酵时间为90-120小时，发酵过程中，采用了补氮操作，在发酵的30-80小时区间内流加50％(w/v)的玉米浆溶液。
8.按权利要求6所述的生产DHA油脂的方法，其特征在于：所述发酵培养基为葡萄糖30-80g/L，酵母提取
物5-20g/L，玉米浆5-20g/L，磷酸二氢钾0.5-8g/L，硫酸镁0.5-3g/L，柠檬酸钠0.5-3g/L，海水晶5-30g/L，维生素B 1 30-200mg/L，维生素B 630-200mg/L，维生素B 12 5-50mg/L和生物素2-50mg/L。
权 利 要 求 书1/1页CN 106010970 A
一种寇氏隐甲藻及其应用
技术领域
[0001]本发明涉及微生物发酵工程领域，具体涉及一种寇氏隐甲藻及利用其高密度发酵生产DHA的方法。
背景技术
[0002]二十二碳六烯酸(DHA)是一种重要的ω-3多不饱和脂肪酸，具有促进脑细胞发育、降血脂、保护视力、抗癌和提高免疫力等重要生理功能，广泛应用在婴幼儿食品及医药行业。另外，DHA还是多种海水鱼类生长发育所需的必需脂肪酸，可以提高鱼苗的成活率和降低白化病的得病率。
[0003]生产DHA的传统原料主要为鱼油，但鱼油生产过程中存在资源有限，产量及质量不稳定，环境污染，纯化工艺复杂且成本高等问题，逐渐被微生物发酵生产DHA所取代。近年来，科学工作者开展了利
用海洋微生物发酵生产DHA的研究，而寇氏隐甲藻是最具商业化生产潜力的微生物之一。寇氏隐甲藻具备生长快、抗逆性强、脂类含量高等特点。此外，在它的脂肪酸中C14:0，C16:0，C22:6(DHA)，占总脂肪酸含量的90％左右，具有很高的营养价值并且相对容易分离。目前，限制其进一步推广的瓶颈是单位成本上的DHA产量较低。
[0004]目前国内利用寇氏隐甲藻制备DHA油脂的专利主要分三方面内容。第一、优良菌种的选育。专利CN 101591617 B，CN 103468575 B，CN 102220307 A和CN 104293824 A等，这些专利通过诱变、基因工程等手段，经过筛选、培养获得高生长速率和高DHA含量的寇氏隐甲藻藻株，但尚未进行规模化的培养；第二、培养基配方及发酵条件的优化。如专利CN 1986822 A，CN 101386873 B，CN 101979623 B，CN 103882067 A，CN 103882068 A等采用简单的培养方法和培养条件的优化，达到提高DHA产量的目的。第三、寇氏隐甲藻油脂提取与分离纯化技术。如专利CN 103864614 B，CN 101168501 B，CN 101307341 B，CN 101824363 B，CN 102559375 A，CN 104544135 A等，通过优化油脂提取工艺方式降低生产成本，提高产物得率。综合上述专利，获得DHA的高产菌株，并结合优良的发酵工艺，获得较高的生物量和油脂含量，是DHA的工业化推广的关键所在。
发明内容
[0005]针对上述问题，本发明提供一种寇氏隐甲藻及其应用。
[0006]为实现上述目的，本发明采用技术方案为：
[0007]一种寇氏隐甲藻，其分类命名为寇氏隐甲藻(Crypthecodinium cohnii)，实验室命名为寇氏隐甲藻SD401菌株，已于2016年04月13日保藏于位于北京市朝阳区北辰西路1号院3号的中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)，其保藏编号为CGMCC No：12239。
[0008]所述寇氏隐甲藻是从广东湛江红树林地区收集的腐叶上采用松花粉垂钓法分离得到。通过培养，在光学显微镜下观察形态及结构发现(图1)：SD401细胞为椭球形，直径在8-20微米，胞内有明显的颗粒状物质，细胞主要采用分裂方式进行繁殖。
[0009]通过培养，提取油脂进行脂肪酸成分检测。从结果中可以看出其主要的长链多不饱和脂肪酸为二十二碳六烯酸(DHA)，其中DHA总脂肪酸的含量在35-55％。饱和脂肪酸主要为十四烷酸和十六烷酸。因此，该藻株脂肪酸组成简单，DHA含量高，具有很好的DHA生产能力。
[0010]寇氏隐甲藻Crypthecodinium cohnii SD401藻株最适温度高、生长速度快。其最适生长温度为30℃-35℃，发酵100小时左右能获得最大的生物量与DHA产量。
[0011]一株寇氏隐甲藻的应用，具体为以所述寇氏隐甲藻为出发菌株，在发酵培养基中高密度发酵获得制备DHA油脂。
[0012]所述发酵温度为30℃-35℃，发酵时间为90-120小时，发酵过程中，采用了补氮操作，在发酵的30-80小时区间内流加50％(w/v)的玉米浆溶液。整个发酵过程中采用了补糖操作，控制体系中葡萄糖浓度在20-60g/L之间，发酵结束时葡萄糖浓度不高于10g/L。[0013]所述发酵培养基为葡萄糖30-80g/L，酵母提取物5-20g/L，玉米浆5-20g/L，磷酸二氢钾0.5-8g/L，硫酸镁0.5-3g/L，柠檬酸钠0.5-3g/L，海水晶5-30g/L，维生素B1 30-200mg/ L，维生素B630-200mg/L，维生素B12 5-50mg/L和生物素2-50mg/L，用水定容至1L。[0014]一种制备生产二十二碳六烯酸的方法，以所述寇氏隐甲藻为出发菌株，在发酵培养基中高密度发酵获得制备DHA油脂。
[0015]具体，是以所述寇氏隐甲藻为出发菌株经一级种子和二级种子发酵后，再接种至发酵培养基中高密度(最终菌浓(生物量)大于100g/L)发酵获得制备DHA油脂。
[0016]所述在发酵培养基中整个发酵过程的发酵温度为30℃-35℃，发酵时间为90-120小时，发酵过程中，采用了补氮操作，在发酵的30-80小时区间内流加50％(w/v)的玉米浆溶液。整个发酵过程中采用了补糖操作，控制体系中葡萄糖浓度在20-60g/L之间，发酵结束时葡萄糖浓度不高于10g/L。
[0017]所述发酵培养基为葡萄糖30-80g/L，酵母提取物5-20g/L，玉米浆5-20g/L，磷酸二氢钾0.5-8g/L，硫酸镁0.5-3g/L，柠檬酸钠0.5-3g/L，海水晶5-30g/L，维生素B1 30-200mg/ L，维生素B6 30-200mg/L，维生素B12 5-50mg/L和生物素2-50mg/L，用水定容至1L。[0018]本发明与已有技术相比有以下显著特点和积极效果：
[0019] 1.本发明筛选得到一株在较高温度下高产DHA的寇氏隐甲藻藻株，该藻株能在30℃-35℃条件下快速生长，并大量积累二十二碳六烯酸。
[0020] 2.本发明所得藻株生长速度快，发酵时间短。利用寇氏隐甲藻菌株高密度发酵生产二十二碳六烯酸。在上述发酵条件下，90-120小时即能获得最大产量。经发酵后获得生物量为90-130g/L，DHA产量为23-35g/L。
[0021] 3.本发明所得藻株从广东省湛江市红树林水域中筛选得到可高产二十二碳六烯酸的寇氏隐甲藻Crypthecodinium cohnii SD401藻株，具有很好的工业应用价值。所筛选能高产DHA的寇氏隐甲藻，以及利用其高密度发酵生产DHA油脂的方法。
附图说明
[0022]图1是寇氏隐甲藻SD401菌株在显微镜下的形态图。
具体实施方式
[0023]实施例1：
[0024]寇氏隐甲藻，其分类命名为寇氏隐甲藻(Crypthecodinium cohnii)，实验室命名为寇氏隐甲藻SD40
1菌株，已于2016年04月13日保藏于位于北京市朝阳区北辰西路1号院3号的中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)，其保藏编号为CGMCC No：12239。
[0025]所述寇氏隐甲藻是从广东电白水东湾红树林地区收集的腐叶上采用松花粉垂钓法分离得到。通过培养，在光学显微镜下观察形态及结构发现(图1)：SD401细胞为椭球形，直径在8～20微米，胞内有明显的颗粒状物质，细胞主要采用分裂方式进行繁殖。
[0026]通过培养，提取油脂进行脂肪酸成分检测。从结果中可以看出其主要的长链多不饱和脂肪酸为二十二碳六烯酸(DHA)，饱和脂肪酸主要为十四烷酸和十六烷酸。因此，该藻株脂肪酸组成简单，DHA含量高，具有很好的DHA生产能力。
[0027]表1发酵后寇氏隐甲藻SD401胞内脂肪酸组成情况
[0028]
[0029]
[0030]实施例2：
[0031]不同碳源对寇氏隐甲藻SD401菌株生长和油脂积累的影响
[0032]在250ml的三角摇瓶中，配置50ml培养基，氮源为酵母提取物20g/L，盐度为15，分别加入不同的碳源(甘油、葡萄糖、果糖、木糖、蔗糖、麦芽糖和淀粉)，浓度为60g/L，调pH值为6.0，高压灭菌后，接入5ml预培养的菌种种子液，在空气浴振荡器上30℃振荡培养120小时，振荡转速为200rpm。离心收集菌体，冷冻干燥至恒重，测其干重；取部分菌体，按常规的氯仿-甲醇法提取油脂并甲脂化，通过GC-MS测定菌体中DHA的百分含量。结果见表2。[0033]表2不同碳源对寇氏隐甲藻SD401藻株生长和油脂积累的影响
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