(19)中华人民共和国国家知识产权局
(12)发明专利申请
(10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请号 201610280521.6
(22)申请日 2016.04.28
(71)申请人 中国水产科学研究院黄海水产研究
所
地址 266071 山东省青岛市市南区南京路
106号
(72)发明人 郑兰红 朱美虹 杨康利 梁方方
康道乐
(74)专利代理机构 北京科亿知识产权代理事务
所(普通合伙) 11350
代理人 李素红
(51)Int.Cl.
C12N 9/50(2006.01)
C12N 15/57(2006.01)
C12N 15/70(2006.01)
A61K 38/48(2006.01)A61P 29/00(2006.01) (54)发明名称
(57)摘要
一种蛋白酶及其制备和应用，
属于基因工程和生物酶技术领域，它的核苷酸序列为SEQ ID
NO.1，该序列能编码所述蛋白酶。所述蛋白酶的
氨基酸序列为SEQ ID NO.2。本发明方法能成功
的构建出重组菌并能表达出具有活性的蛋白，目
的蛋白产量高且该蛋白具有较好的蛋白酶活性，
蛋白酶活力为116万U，为该蛋白酶在工业化生
产、医药保健和环境改善中提供更好的技术支持
和物质基础，
具有较好的研究和应用价值。权利要求书1页 说明书4页序列表4页 附图1页CN 105754974 A 2016.07.13
C N 105754974
A
1.一种蛋白酶，其特征在于它的核苷酸序列为SEQ ID NO.1，该序列能编码所述蛋白酶。
2.权利要求1所述蛋白酶的氨基酸序列为SEQ ID NO.2。
3.权利要求1所述蛋白酶的制备方法，其特征在于所述方法包括构建原核表达载体，利用超滤和离子交换方法纯化重组蛋白，表达载体为PET22b，所用的酶为NcoI和HindIII，其中特异性引物5’-CATGCCATGGATGCAAGTACAGGCAGTC-3’为PCR扩增反应的正向引物，5’-CCCAAGCTTATTTTATCTGTACCACGC-3’为相应的反向引物，以蛋白酶的DNA为模版，进行PCR扩增反应，获得带有酶切位点的目的片段，将目的基因与载体双酶切后连接，连接产物转化到感受态细胞E.coli BL21(DE3)中，涂布在Amp/LB琼脂固态培养基上培养，将长出的阳性克隆重组菌培养发酵，发酵液经离心通过超滤、硫酸铵沉淀、离子交换方法分离纯化得到重组蛋白。
4.权利要求1或2所述蛋白酶的制备方法，其特征在于它的具体步骤如下：
1)采用特异的引物对编码蛋白的基因进行扩增，扩增的同时在引物上设计NcoI和HindIII的酶切位点，引物为：
Forward：5’-CATGCCATGGATGCAAGTACAGGCAGTC-3’
Reverse：5’-CCCAAGCTTATTTTATCTGTACCACGC-3’
PCR扩增体系为：2×ESTaqMasterMix25μL，上游引物2μL，下游引物2μL，DNA模板2μL，加FreeWater至50μL；PCR扩增条件为：90～96℃预变性4～7min，902～97℃变性30s，54～60℃退火30s，72～77℃延伸0.9～1.2min，循环25～35次，最后71～76℃延伸8～12min；
2)用NcoI和HindIII分别双酶切PET22b质粒和扩增产物，电泳后回收目的产物，然后用T4DNA连接酶16℃过夜连接，将目的基因与载体连接，最后将连接产物转化到感受态细胞E.coliBL21(DE3)中，涂布在Amp/LB琼脂固态培养基上，37℃过夜培养，获得重组菌株，其中氨苄浓度为100～122mg/L，琼脂浓度为1.9～2.3％；
3)将重组菌株接种于灭菌后的初始发酵液中，在37℃，200～300r/min下，发酵培养，待培养至OD600＝0.7～1.0时，加入终浓度为0.8～1.2mM的IPTG，30℃，100～300r/min诱导8～10h，得到发酵菌液，所述的初始发酵液，以质量分数计，包括0.9～1.6％的胰蛋白胨，0.8～1.4％的氯化钠，0.5～0.7％的酵母提取物，余量为水；
将发酵液离心，取上清，然后使用3kd、50kd的超滤膜截留；接着使用30％～60％的硫酸铵沉淀，将得到的沉淀重溶后透析、除盐；然后使用阳离子交换谱，经过挂柱、洗脱，得到纯化的活性蛋白。
5.权利要求1-4任何一项所述蛋白酶或所述方法制备的蛋白酶的应用，所述应用包括在洗涤工业、制革工业和食品工业中应用。
6.权利要求1-4任何一项所述蛋白酶或所述方法制备的蛋白酶在制备消炎剂中的应用。
权 利 要 求 书1/1页CN 105754974 A
一种蛋白酶及其制备和应用
技术领域
[0001]本发明属于基因工程和生物酶技术领域，具体地涉及一种蛋白酶及其制备和应用。
背景技术
[0002]蛋白酶是催化蛋白质多肽链肽键水解的一类酶，其广泛存在于动植物和微生物中，由于其来源丰富，容易提纯，分子量小，功能简单等特点，使得蛋白酶在酶学研究中较早发展起来，同时也具有广泛的工业用途。到21世纪初，来源于微生物的蛋白酶已经被报道超过900种，生物体的正常生理活动和疾病的发生，如消化吸收、消炎、血压调节、机体衰老和癌症转移等都与蛋白酶有关。蛋白酶已经应用于洗涤、制革、饲料、食品、酿造、医药化工工业和环境资源的利用与开发等领域，有着广泛的用途，其在整个酶制品市场中占有重要的地位，蛋白酶生产总值达到整个酶制剂市场销售额的65％。
[0003]蛋白酶可以应用于洗涤工业，欧洲加酶洗衣粉所占的比例已经达到80％左右，全世界加酶洗衣粉
在洗涤剂行业中也占有重要地位。在制革工业中蛋白酶也起着重要的作用，蛋白酶不作用胶原，而只能水解角蛋白、弹性蛋白和球蛋白等杂质，在浸水时可促进皮子吸水，脱毛时可分解毛皮与表皮间连接的类粘蛋白，使胶原纤维松散，使皮革更加柔软。蛋白酶也可以改性毛纺织物，省去以往处理过程中的化学试剂前处理，方法简单，经济环保。曹张军等利用假单胞菌(Pseudomonas)3096-4(保藏编号为CGMCC No.3888)等微生物发酵得到一种复合酶，用该复合酶处理的毛或毛纺织物抗毡缩性和机械强度都有提高，适 用于工业化生产(申请公布号：CN101935642A)。蛋白酶在食品工业上主要应用包括蛋白类食品发酵生产功能性低聚肽，烤焙食品，肉类嫩化和酒类澄清等。西方国家上市的蛋白酶大都来自可食用的微生物，来源安全。张翠翠等利用木瓜蛋白酶、复合蛋白酶和风味蛋白酶等进行复配，缩短了酶解时间，制备牛肉酶解物用于美拉德反应的反应物香气更加逼真，自然，口感舒适，口腔留香更持久，弥补了现有技术的缺陷(申请公布号：CN103266097A)。蛋白酶也可用于临床医药和保健，调节人体的功能，增强机体免疫，提高机体抵抗疾病的能力等。在生物体内的一些生理过程中它们起着极为重要和广泛的调控作用，临床上蛋白酶可用作消化剂、消炎剂、膳食补充剂和外科的清创剂等。它们在辅助缓解炎症反应和改善心脑血管代谢调节等方面有着重要作用，例如胰蛋白酶，已经广泛应用于心血管疾病医治和真菌基础性研究等领域。在可持续发展方面蛋白酶也有广泛的应用，利用蛋白酶可以水解一些蛋白质含量丰富的生物产品下脚料生产产品，变废为宝，保护环境。近年来环境污染日益加剧，环境问题越来越受到人们的关注，工业上使用对环境友好的生产工艺也成为未来工业发展的主流，为蛋白酶的应用创造了更加有利的条件。现如今基因工程技术及酶技术的快速发展使蛋白酶来源更廉价广泛，可以让蛋白酶应用到更多的领域中去。
发明内容
[0004]本发明要解决的技术问题在于提供一种蛋白酶及其制备和应用，为蛋白酶的工业
应用提供新品种。
[0005]本发明是通过如下技术方案来实现的：
[0006]一种蛋白酶，其核苷酸序列见SEQ ID NO.1，该序列能编码上述蛋白酶。对该段核苷酸序列进行生物信息学分析，其中SEQ ID NO.1中16-105位核苷酸序 列编码的是信号肽，106-303位核苷酸序列编码的是连接肽，304-825位核苷酸序列编码的是活性蛋白。[0007]进一步，所述蛋白酶的氨基酸序列见SEQ ID NO.2。通过氨基酸序列对比及实验证实，该蛋白第一次被发现具有蛋白酶活性，为一种新型的金属蛋白酶。
[0008]本发明还涉及所述蛋白酶的制备方法，所述方法包括构建原核表达载体，利用超滤和离子交换方法纯化重组蛋白，表达载体为PET22b，所用的酶为NcoI和HindIII，其中特异性引物5’-CATGCCATGGATGCAAGTACAGGCAGTC-3’为PCR扩增反应的正向引物，5’-CCCAAGCTTATTTTATCTGTACCACGC-3’为相应的反向引物。以蛋白酶的DNA为模版，进行PCR扩增反应，获得带有酶切位点的目的片段，将目的基因与载体双酶切后连接，连接产物转化到感受态细胞E.c
oli BL21(DE3)中，涂布在Amp/LB琼脂固态培养基上培养，将长出的阳性克隆重组菌培养发酵，发酵液经离心通过超滤、硫酸铵沉淀、离子交换方法分离纯化得到重组蛋白。
[0009]本发明还涉及所述蛋白酶的具体制备方法，步骤如下：
[0010]1)采用特异的引物对编码蛋白的基因进行扩增，扩增的同时在引物上设计NcoI和HindIII的酶切位点，引物为：
[0011]Forward：5’-CATGCCATGGATGCAAGTACAGGCAGTC-3’
[0012]Reverse：5’-CCCAAGCTTATTTTATCTGTACCACGC-3’
[0013]PCR扩增体系为：2×ESTaqMasterMix25μL，上游引物2μL，下游引物2μL，DNA模板2μL，加FreeWater至50μL；PCR扩增条件为：90～96℃预变性4～7min，902～97℃变性30s，54～60℃退火30s，72～77℃延伸0.9～1.2min，循环25～35次，最后71～76℃延伸8～12min；[0014]2)用NcoI和HindIII分别双酶切PET22b质粒和扩增产物，电泳后回收目的 产物，然后用T4DNA连接酶16℃过夜连接，将目的基因与载体连接，最后将连接产物转化到感受态细胞E.coliBL21(DE3)中，涂布在Amp/LB琼脂固态培养基上，37℃过夜培养，获得重组菌株，其中氨苄浓度为100～122mg/L，琼脂浓度为1.9～2.3％；
[0015]3)将重组菌株接种于灭菌后的初始发酵液中，在37℃，200～300r/min下，发酵培养，待培养至OD600＝0.7～1.0时，加入终浓度为0.8～1.2mM的IPTG，30℃，100～300r/min 诱导8～10h，得到发酵菌液，所述的初始发酵液，以质量分数计，包括0.9～1.6％的胰蛋白胨，0.8～1.4％的氯化钠，0.5～0.7％的酵母提取物，余量为水；
[0016]将发酵液离心，取上清，然后使用3kd、50kd的超滤膜截留；接着使用30％～60％的硫酸铵沉淀，将得到的沉淀重溶后透析、除盐；然后使用阳离子交换谱，经过挂柱、洗脱，得到纯化的活性蛋白。
[0017]本发明提供所述蛋白酶的应用，所述应用包括在洗涤工业、制革工业和食品工业；该蛋白可以应用在洗涤工业，作为洗涤添加剂；应用在制革工业，改善脱毛条件，提高革制品质量；应用在食品工业发酵生产功能性低聚肽，提高食品口感等。
[0018]本发明提供所述蛋白酶在制备消炎剂缓解炎症反应，用作外科清创剂辅助手术等方面的应用。
[0019]本发明与现有技术相比的有益效果：
[0020]该方法能成功的构建出重组菌并能表达出具有活性的蛋白，目的蛋白产量高且该蛋白具有较好的蛋白酶活性，蛋白酶活力为116万U，为该蛋白酶在工业化生产、医药保健和环境改善中提供更好的技术支持和物质基础，具有较好的研究和应用价值。
附图说明
[0021]图1重组蛋白在大肠杆菌(E.coli)BL21(DE3)的诱导表达及分离纯化。图示中M为蛋白Marker，1为纯化的重组蛋白(方框内)，2为未诱导重组菌，3为诱导的重组菌(方框内为重组蛋白)。
具体实施方式
[0022]下面通过实施例结合附图来对本发明的技术方案作进一步解释，但本发明的保护范围不受实施例任何形式上的限制。
[0023]实施例一
[0024]一种蛋白酶，其核苷酸序列见SEQ ID NO.1，该序列能编码上述蛋白酶。对该段核苷酸序列进行生物信息学分析，其中SEQ ID NO.1中16-105位核苷酸序列编码的是信号肽，106-303位核苷酸序列编码的是连接肽，304-825位核苷酸序列编码的是活性蛋白。[0025]所述蛋白酶的氨基酸序列见SEQ ID NO.2。通过氨基酸序列对比发现该蛋白为一种新型的金属蛋白酶，第一次被发现具有蛋白酶活性。
[0026]实施例二、重组菌的构建
[0027]1)采用特异的引物对编码蛋白酶的基因(序列见SEQ ID NO.1)进行扩增。扩增的同时在引物上设计NcoI和HindIII的酶切位点，引物为：
[0028]Forward：5’-CATGCCATGGATGCAAGTACAGGCAGTC-3’
[0029]Reverse：5’-CCCAAGCTTATTTTATCTGTACCACGC-3’
[0030]PCR扩增体系为：2×ESTaqMasterMix25μL，上游引物2μL，下游引物2μL，DNA模板2μL，加FreeWater至50μL；PCR扩增条件为：95℃预变性6min，95℃变性30s，55℃退火30s，75℃延伸1.0min，循环30次，最后72℃延伸10min。
[0031]2)用NcoI和HindIII分别双酶切PET22b质粒和扩增产物，1％电泳后回收 目的产物。然后用T4DNA连接酶16℃过夜连接，将目的基因与载体连接。最后将连接产物转化到感受态细胞E.coli BL21(DE3)中，涂布在Amp/LB琼脂固态培养基上，37℃过夜培养。其中氨苄浓度为110mg/L，琼脂浓度为2.0％。
[0032]3)将长出的阳性克隆用菌液PCR、双酶切质粒和测序进行鉴定，获得重组菌株。[0033]实施例三、重组菌的发酵培养及重组蛋白的分离纯化
[0034]将重组菌株接种于灭菌后的初始发酵液中，在37℃，250r/min下，发酵培养，待培养至OD600＝0.8时，加入终浓度为1.0mM的IPTG，30℃，200r/min诱导9h。得到发酵菌液。所述的初始发酵液，以质量分数计，包括1.2％的胰蛋白胨，1.0％的氯化钠，0.6％的酵母提取物。
[0035]将发酵液于10000rmp、10min、4℃离心，取上清，然后使用3kd、50kd的超滤膜截留；接着使用
30％～60％的硫酸铵沉淀，将得到的沉淀重溶后透析、除盐；然后使用Q Fast
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