(10)申请公布号 (43)申请公布日 2013.09.11
C N 103289900 A
(21)申请号 201210041247.9(22)申请日 2012.02.22CGMCC No.5412 2011.10.28
C12N 1/14(2006.01)C12P 21/04(2006.01)C12R 1/645(2006.01)
(71)申请人上海来益生物药物研究开发中心有
限责任公司
地址201203 上海市浦东新区张江牛顿路
200号8号楼5楼
申请人浙江医药股份有限公司新昌制药厂(72)发明人罗敏玉 孙新强 朱丽 陈迎迎
阮丽军 张磊 阮林高(74)专利代理机构上海智信专利代理有限公司
31002
代理人薛琦(54)发明名称
本发明公开了一种纽莫康定B0高产菌株为Zalerion arboricola ATCC46001菌株的突变菌株，该菌株保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号为CGMCC No.5412。还公开其应用，使得获得纽莫康定B0高产菌株，制备纽莫康定B0的产量达到4500mg/l 左右。
(83)生物保藏信息
(51)Int.Cl.
权利要求书1页 说明书4页
(19)中华人民共和国国家知识产权局
(12)发明专利申请
权利要求书1页 说明书4页(10)申请公布号CN 103289900 A *CN103289900A*
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1.一种纽莫康定B0高产菌株为Zalerion arboricola ATCC 46001菌株的突变菌株，其特征在于，该菌株的保藏号为CGMCC No.5412。
2.一种如权利要求1所述的菌株用于生产纽莫康定B0的应用。
3.一种纽莫康定B0的生产方法，其特征在于，通过发酵权利要求1所述的Zalerion arboricola CGMCC No.5412获得纽莫康定B0。
4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，所述发酵条件如下：发酵培养基(wt)：蔗糖12.5％，谷氨酸钠0.8％，酵母粉0.8％，脯氨酸1.5％，KH 2PO 4 0.15％，七水合硫酸镁0.04％，微量元素1ml ，MES 缓冲盐1.5％，pH
5.3；
其中，微量元素组成(g/l)：七水硫酸亚铁1.0，一水硫酸锰0.2，二水氯化钙0.1，硼酸0.056，二水氯化铜0.025，四水钼酸铵0.019，12N 盐酸50ml ；
发酵液培养温度25℃，培养7天；摇瓶转速220rpm/min 。
权 利 要 求 书
CN 103289900 A
纽莫康定B0高产菌株及其应用
技术领域
[0001] 本发明属于生物工程的技术领域，具体的说，是关于纽莫康定B0高产菌株及其应用。
背景技术
[0002] 在过去的二十多年时间里严重危害人类生命健康的真菌感染，无论是在死亡率以及感染的种类方面都在不断的增加，特别是在免疫抑制病人中。目前用于临床深部真菌感染的主要药物是唑类抗真菌药物和两性霉素B。
[0003] 虽然这两类药物对控制临床深部真菌感染起到了重要的作用，但由于这些药物具有以下三方面的不足，使深部真菌感染疾病的死亡率居高不下：
[0004] 一是由于这两类药物的作用靶点都是真菌细胞膜，其选择性差而导致产生较大的毒副作用；
[0005] 二是由于临床耐药真菌的广泛出现而使这些药物疗效降低；
[0006] 三是这些药物对诸如曲霉和白念珠菌等真菌的敏感性不强，致使临床上难以控制这类真菌感染的疾病。
[0007] 芬净类(棘球菌素类)抗生素是20世纪70年代发现的一组天然产物，具有相同的环状多肽核心和不同的脂肪酸侧链的结构特征，能够非竞争性地抑制真菌细胞壁β-1，3-葡聚糖合成酶的活性。其独特的作用机制，不仅毒副作用低，且对一些唑类和两性霉素B 耐药的真菌具有很强的抗菌活性，尤其是对诸如曲霉和白念珠菌等呈现上升趋势的真菌具有独特的疗效，是目前临床深部真菌感染的“王牌抗生素”。因此，国外大制药公司经过30多年的研究开发，已经成功地上市了三个芬净类抗真菌药物，即卡帕芬净、卡泊芬净和阿尼芬净。
[0008] 卡泊芬净(Caspofungin)是由美国默克公司研发、首个棘白菌素类抗真菌药物。与传统的作用于真菌浆膜中麦角固醇的抗真菌药不同，卡泊芬净是一种1，3-β-D-葡聚糖合成抑制剂。1，3-β-D-葡聚糖是
真菌细胞壁的重要组成部分，卡泊芬净通过抑制真菌1，3-β-D-葡聚糖合成酶，使真菌细胞壁中1，3-β-D-葡聚糖含量减少，造成细胞壁的结构异常、细胞破裂，细胞内容物漏出，最终导致真菌细胞死亡。卡泊芬净对念珠菌属和曲霉菌属具有良好的抑菌活性，同时对唑类和两性霉素B耐药的菌株也有抑菌活性。由于哺乳动物细胞没有细胞壁，缺乏1，3-β-D-葡聚糖合成酶，故卡泊芬净对真菌具有较高的特异性，一般不会产生类似两性霉素B那样的细胞毒性，并与现有的抗真菌剂之间不存在交叉耐药性。
[0009] 卡泊芬净通过对纽莫康定B0(Pneumocandin B0)进行结构修饰获得。纽莫康定B0由Zalerion arboricola发酵产生。由于纽莫康定B0的发酵产量很低，且发酵成分复杂，进而影响了卡泊芬净的产量。因此，本领域迫切需要一种纽莫康定B0产量高、遗传性状稳定的高产菌株。
发明内容
[0010] 本申请发明人以Zalerion arboricola ATCC 46001菌株为出发菌，经过(菌种选育、物理化学)随机诱变后筛选到一株纽莫康定B0高产菌株，并将其进行了保藏，保藏号为CGMCC No.5412。
[0011] 因此，本发明的第一个目的在于，提供一种，Zalerion arboricola，其保藏号为CGMCC No.5412。
[0012] 本发明的第二个目的在于，提供所述Zalerion arboricola，其保藏号为CGMCC No.5412用于生产纽莫康定B0的应用。
[0013] 本发明的第三个目的在于，提供一种纽莫康定B0的的生产方法。
[0014] 本发明的目的在于，提供一种纽莫康定B0高产菌株的发酵培养基。
[0015] 本发明所需要解决的技术问题，可以通过以下技术方案来实现：
[0016] 作为本发明的第一方面，一种纽莫康定B0高产菌株为Zalerion arboricola ATCC 46001菌株的突变菌株，该菌株保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号为CGMCC No.5412，保藏日期2011 年10月28日。
[0017] 作为本发明的第二方面，所述的菌株用于生产纽莫康定B0的应用。
[0018] 作为本发明的第三方面，一种纽莫康定B0的生产方法，其特征在于，通过发酵权利要求1所述的Zalerion arboricola CGMCC No.5412获得纽莫康定B0。
[0019] 所述发酵条件如下：
[0020] 发酵培养基(wt)：蔗糖12.5％，谷氨酸钠0.8％，酵母粉0.8％，脯氨酸1.5％，
KH
2PO
4
0.15％，七水合硫酸镁0.04％，微量元素1ml，MES缓冲盐1.5％，pH 5.3；
[0021] 其中，微量元素组成(g/l)：七水硫酸亚铁1.0，一水硫酸锰0.2，二水氯化钙0.1，硼酸0.056，二水氯化铜0.025，四水钼酸铵0.019，12N盐酸50ml；
[0022] 发酵液培养温度25℃，培养7天；摇瓶转速220rpm/min。
[0023] 经过发酵获得的发酵液中纽莫康定B0的含量达到4500mg/l左右。
[0024] 本发明的出发菌株经原生质体制备、UV诱变、NTG诱变、γ-射线(60Co)诱变、原生质体融合等技术，通过反复筛选，获得纽莫康定B0高产菌株，纽莫康定B0的含量达到4500mg/l左右。
[0025] 本发明的有益效果：本发明提供的Zalerion arboricola菌株，以及本发明提供的培养条件，能高产纽莫康定B0，并且遗传性状稳定，具有很高的工业化价值。
具体实施方式
[0026] 以下结合具体实施例，对本发明作进一步说明。应理解，以下实施例仅用于说明本发明而非用于限定本发明的范围。
[0027] 下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，或厂商提供的条件进行。
[0028] 本申请发明人以Zalerion arboricola ATCC 46001菌株为出发菌，经过(菌种选育、物理化学)随机诱变后筛选到一株纽莫康定B0高产菌株，并将其进行了保藏，具体的保藏信息如下：
[0029] 中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心
[0030] 北京市朝阳区北辰西路1号院中科院微生物研究所邮编：100101
[0031] 保藏日期2011年10月28日
[0032] 保藏号为CGMCC No.5412 Zalerion arboricola
[0033] 实施例1 菌株稳定性考察
[0034] 培养基：
[0035] 斜面/平板培养基：马铃薯葡萄糖琼脂培养基。
[0036] 种子培养基(％)：葡萄糖2.5，KH2PO40.9，酵母粉0.5，药媒(棉籽精粉，中棉紫光，下同) 1.0，85％乳酸0.2ml，微量元素0.1ml，pH 6.0
[0037] 发酵培养基(％)：蔗糖12.5，谷氨酸钠0.8，酵母粉0.8，脯氨酸1.5，KH2PO4 0.15，七水合硫酸镁0.04，微量元素1ml，MES缓冲盐1.5，pH 5.3。
[0038] 微量元素组成(g/L)：七水硫酸亚铁1.0，一水硫酸锰0.2，二水氯化钙0.1，硼酸0.056，二水氯化铜0.025，四水钼酸铵0.019，12N盐酸50ml。
[0039] 培养条件：
[0040] 斜面培养温度28℃，培养时间5天；
[0041] 种子液培养温度25℃，培养3天；发酵液培养温度25℃，培养7天。摇瓶转速220rpm/min。
[0042] 每一代菌株摇瓶培养5瓶，进行平行实验。HPLC检测发酵产物，取所测含量的平均值。
[0043] 发酵液处理过程：发酵液2ml加入8ml甲醇，振荡混匀后浸泡2小时。取上清1ml 于EP管12000rpm离心10分钟，上清进行HPLC检测。
[0044] HPLC检测条件：
[0045] 谱柱：Hypersil ODS2，C-18，4.6×250mm，5μm
[0046] 检测器：Aligent 1100，DAD(210，223，260，280，276)
[0047] 检测波长：210nm
[0048] 柱温：40℃
[0049] 流速：1ml/min
[0050] 流动相：A：水，B：甲醇
[0051] 分析时间：15min
[0052] 梯度条件如下：post time＝5min
[0053] 表1 HPLC的梯度条件
[0054]
Time(min) A％ B％ FLOW
0 25 75 1.0ml/min
15 10 90 1.0ml/min
20 0 100 1.0ml/min
[0055] 检测结果见表2。
[0056] 表2 不同传代数的突变菌株中纽莫康定B0含量(mg/l)。
[0057]
传代数 1 2 3 4
纽莫康定B0含量mg/l 4450 4589 4438 4516
[0058] 由表2可见，该突变菌株经过传察证明遗传稳定性，合理的传代后纽莫康定
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