[19]
中华人民共和国国家知识产权局
[12]发明专利申请公布说明书
[11]公开号CN 101368177A [43]公开日2009年2月18日
[21]申请号200810231714.8[22]申请日2008.10.13
[21]申请号200810231714.8
[71]申请人西北农林科技大学
地址712100陕西省西安市杨凌农业示范区西农
路22号
[72]发明人安德荣 刘双发 [74]专利代理机构西安新思维专利商标事务所有限公司代理人韩翎
[51]Int.CI.C12N 9/56 (2006.01)C12R 1/125 (2006.01)
权利要求书 4 页 说明书 10 页 附图 1 页
[54]发明名称
产工艺
[57]摘要
本发明涉及一种微生物发酵法生产枯草芽孢杆
菌碱性蛋白酶的生产工艺，其采用微生物发酵生产
碱性蛋白酶，周期短，营养需求低，提取工艺简单，
降低了成本，同时提高了蛋白酶的回收率。本发明
包括以下步骤：(1)菌种培养：采用种子培养基对
枯草芽孢杆菌种进行扩大培养；(2)发酵培养基配
制；(3)发酵：将枯草芽孢杆菌菌种接入摇瓶，进
行发酵得发酵液；(4)粗提：发酵液经预处理后离
心，脱，过滤和减压干燥得粗品碱性蛋白酶；
(5)精制：粗品经纯化溶解后，盐析，透析，超滤
浓缩，凝胶过滤层析，然后干燥浓缩得成品。
200810231714.8权 利 要 求 书第1/4页 1.一种微生物发酵法生产枯草芽孢杆菌碱性蛋白酶的生产工艺，其特征在于包括以下步骤：
(1)菌种培养：采用种子培养基对枯草芽孢杆菌种进行扩大培养；
(2)发酵培养基配制；
(3)发酵：将枯草芽孢杆菌菌种接入摇瓶，进行发酵得发酵液；
(4)粗提：发酵液经预处理后离心，脱，过滤和减压干燥得粗品碱性蛋白酶；
(5)精制：粗品经纯化溶解后，盐析，透析，超滤浓缩，凝胶过滤层析，然后干燥浓缩得成品。
2.根据权利要求1所述的微生物发酵法生产枯草芽孢杆菌碱性蛋白酶的生产工艺，其特征在于：步骤(1)中发酵培养基的配方为：葡萄糖1.2％+蔗糖0.6％十淀粉1.2％，豆饼粉3％，酵母粉0.3％，K2HPO4·3H
2O0.2％，其余以蒸馏水补充，其中百分比为w/w。
3.根据权利要求1所述的微生物发酵法生产枯草芽孢杆菌碱性蛋白酶的生产工艺，其特征在于：步骤(3)中发酵条件为发酵时间36h，温度36℃，初始PH值8.0，摇瓶转速150r/min。
4.根据权利要求1所述的微生物发酵法生产枯草芽孢杆菌碱性蛋白酶的生产工艺，其特征在于：步骤(3)中枯草芽孢杆菌的培养方法为：
(1)：菌种培养基选用：采用LB液体培养基；
(2)：将配置好的LB培养基调节PH至7.8，分装三角瓶，在0.105Mpa蒸汽压力灭菌30min，自然冷却至45℃，24h后无菌条件下接种枯草芽孢杆菌菌种，38℃下170r/min摇床培养36-38h；
(3)：无菌条件下将扩大培养的菌液接入发酵培养基。
5.根据权利要求1所述的微生物发酵法生产枯草芽孢杆菌碱性蛋白酶的生产工艺，其特征在于：在发酵液中加入植物油作为消泡剂，加入量为0.3％w/w。
6.根据权利要求1所述的微生物发酵法生产枯草芽孢杆菌碱性蛋白酶的生产工艺，其特征在于：发酵液的处理和产品制备过程为：
(1)发酵液的预处理：
取发酵完毕的发酵液100ml，加入絮凝剂NaAlO2，室温搅拌8min后静置待分层；絮凝剂N a A l O2的用量以质量百分数0.1％—0.15％为宜；
(2)离心：
将预处理后的发酵液的上清液装入离心管，在4℃条件下8000r/min离心8min；
(3)脱：
向离心液中加入1％的中颗粒活性炭，用水浴加热至90℃，保温搅拌30分钟，趁热过滤，如滤液颜加重，可用活性炭再度脱，直至滤液为无或微黄为止；
(5)纸板过滤：过滤纸板由孔径30～50μm的棉花纤维、石棉和硅藻土组
成，纸板过滤机的压力为0.3M P a，取滤液低温干燥可得粗蛋白酶；
(6)盐析：
将硫酸铵晶体磨成粉末，在冰浴条件下边搅拌边加入pH为7.8的粗蛋白酶溶液中，然后继续搅拌1h放置
于4℃条件下4000r/min离心30min，收集沉淀，溶于定量缓冲液中；
(7)透析：
将盐析获得的沉淀物溶解于装有0.2mol/LpH7.4硼酸缓冲液中的透析袋中，扎好两端，置于10倍酶液体积的蒸馏水中4℃透析过夜，其间需换水4次，最后以饱和BaCL2来检测硫酸铵是否透析完全；
(8)超滤：
将透析所得酶液置于超滤容器中在4℃的环境中，在氮气压力0.5个大气压力下，用截留分子量为10万的膜超滤5h，收集截留的液体；
(9)离子交换柱层析：
选用阴离子交换树脂DEAE-Sephadex A50作为填充介质，将DEAE-Sephadex A50用蒸馏水充分溶胀，采用浮选法除去过细的粒子，放置一定时间后，倒去上清液，至上清液不含细粒为止；用0.1mol/LHCL浸泡20min，再用0.1mol/LNaOH 浸泡20min，最后用0.1mol/LHCL浸泡20min；用上柱缓冲夜平衡几次，抽真空，然后采用快速装柱法装入树脂，避免产生气泡；用洗脱液平衡若干天；洗脱液为50mmol/L，pH7.4的Tris-HCL缓冲液，洗脱速度为2.8ml/10min，每十分钟收集一管；收集蛋白酶活性峰，浓缩。
(10)SephadexG-75凝胶柱层析：
在低温4℃的环境下，选择SephadexG-75作为填充介质；称取一定量的SephadexG-75在沸水中充分溶胀，冷却，装柱；将DEAE-Sephadex A50收集到的活性峰浓缩后上样；用0.1mol/LpH7.4的Tris-HCL缓冲液进行洗脱，洗脱速度为0.5ml/min，用核酸/蛋白检测仪检测，收集含碱性蛋白酶活性组分，然后冷冻干燥浓缩于4℃保存。
豫公网安备41160202000603
站长QQ:729038198
关于我们
投诉建议