(19)中华人民共和国国家知识产权局
(12)发明专利申请
(10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请号 201610622349.8
(22)申请日 2016.07.29
(71)申请人 玉林师范学院
地址 537000 广西壮族自治区玉林市教育
路299号
(72)发明人 周盛 王小敏
(74)专利代理机构 北京天奇智新知识产权代理
有限公司 11340
代理人 但玉梅
(51)Int.Cl.
C12N 1/38(2006.01)
C12N 1/36(2006.01)
C12N 1/02(2006.01)
C12N 1/14(2006.01)
C12N 1/20(2006.01)
C12N 1/12(2006.01)C12R 1/89(2006.01)
(54)发明名称固碳氮微生物的培养基及固碳氮微生物的筛选方法(57)摘要本发明提供固碳氮微生物的培养基及固碳氮微生物的筛选方法，属于微生物技术领域。筛选方法包括以下步骤：(1)兼性固氮碳培养基的配制；(2)微生物的选择；(3)好氧驯化富集；(4)厌氧驯化富集；(5)梯度平板分离；利用无氮碳培养基可以有效地筛选出兼性固氮碳的微生物，同时利用好氧和厌氧驯化富集处理，可以进一步使所筛选出来的兼性固氮碳微生物也具有兼性厌氧性，使筛选出的微生物能适应富氧或缺氧等恶劣条件，提高兼性固氮碳微生物的适应性，并利用电子传递体进行信息交流，促进微生物的呼吸和生长，微量元素的添加也大幅缩短了筛选周期，本发明的筛选方法不仅降低固氮碳成本，同时降低温室气体的排放，以达变废为宝，循环利 用。权利要求书2页 说明书7页CN 106222124 A 2016.12.14
C N 106222124
A
1.固碳氮微生物的培养基，其特征在于：所述培养基的组成及重量为：KH2PO4 1.0～1.5g、K2HPO4
2.0～2.5g、MgSO4·7H2O 0.2～0.3g、NaCl 20～30g、CaCl20.01～0.02g、FeSO4 0.01～0.02g，电子传递物质2.0～
3.0g、微量元素混合液2～3ml；
其中微量元素混合液中的溶质为：Na2MoO4·2H2O 1.68～1.70mg、H3BO3 0.4～0.5mg、ZnSO4·7H2O 1.0～1.5mg、MnSO4·5H2O 1.0～1.5mg、CuSO4·5H2O 7.0～8.0mg、CoCl2·6H2O
1.0～1.5mg、NiSO4·7H2O 1.0～1.5mg。
2.根据权利要求1所述固碳氮微生物的培养基，其特征在于：所述培养基的组成及重量为：KH2PO4 1.1～1.4g、K2HPO4 2.1～2.4g、MgSO4·7H2O 0.24～0.28g、NaCl 22～28g、CaCl2 0.012～0.018g、FeSO4 0.012～0.018g，电子传递物质2.2～2.8g、微量元素混合液2.2～2.8ml；
其中微量元素混合液中的溶质为：Na2MoO4·2H2O 1.685～1.695mg、H3BO3 0.42～0.48mg、ZnSO4·7H2O 1.1～1.4mg、MnSO4·5H2O 1.1～1.4mg、CuSO4·5H2O 7.2～7.8mg、CoCl2·6H2O 1.1～1.4mg、NiSO4·7H2O 1.1～1.4mg。
3.根据权利要求1所述固碳氮微生物的培养基，其特征在于：所述培养基的组成及重量为：KH2PO4 1.25g、K2HPO4 2.3g、MgSO4·7H2O 0.26g、NaCl 25g、CaCl20.015g、FeSO4 0.015g，电子传递物
质2.5g、微量元素混合液2.5ml；
其中微量元素混合液中的溶质为：Na2MoO4·2H2O 1.69mg、H3BO3 0.45mg、ZnSO4·7H2O 1.3mg、MnSO4·5H2O 1.3mg、CuSO4·5H2O7.5mg、CoCl2·6H2O 1.25mg、NiSO4·7H2O 1.3mg。
4.根据权利要求1～3任意一项所述一种兼性固碳氮微生物的筛选方法，其特征在于：包括以下步骤：
(1)微生物的选择：
菌类采样方法：采样为离地表大于15cm的土壤3份，将三份土壤磨碎混匀后称取1g加入至装有玻璃珠的三角瓶中，并在其中注入9～10ml无菌水，然后置于摇床28～30℃，120～150r/min振荡20～30min，充分混合配置成土壤悬浮液； (2)好氧驯化富集：采用排水换气法配气，将血清瓶装满水后，倒扣于水中，按混合气比例N2∶CO2∶O2＝8.5∶0.5∶1用针筒打入相应量的N2、CO2和O2，用封口膜封口；将无碳氮培养基注入血清瓶中，同时另一针头通过胶塞插入血清瓶中，以便排气；后将步骤(2)中的土壤悬浮液加入到装有无碳氮培养基的血清瓶中，然后置于摇床28～30℃，120～150r/min振荡20～30min，2～3d为一个富集周期，每个周期结束后重新充入混合气，比例N2∶CO2∶O2＝8.5∶0.5∶1，重复富集过程共2～3次得到菌液；
(3)厌氧驯化富集：采用排水换气法配气，将血清瓶装满水后，倒扣于水中，将有氧气氛混合气即空气∶C
O2＝9∶1的气体用针筒打入，用封口膜封口，将无碳氮培养基注入血清瓶中，同时另一针头通过胶塞插入血清瓶中，以便排气，将步骤(3)的菌液转接到新的装有无碳氮培养基的血清瓶中，然后置于摇床28～30℃，120～150r/min振荡20～30min，2～3d为一个富集周期，培养一个周期后，再将无氧气氛混合气N2∶CO2＝9∶1用针筒打入血清瓶中，再以2～3d为一个富集周期，培养一个周期后，再在有氧气氛和无氧气氛条件下重复5～6个周期，最后得到目的菌液；
(4)梯度平板分离：采用10倍梯度稀释方法将目的菌液制成悬液浓度为10-1、10-2、10-3、10-4、10-5、10-6、10-7，运用涂布平板培养法，先将无碳氮培养基倒入无菌平板中，待凝固后编
号10-1、10-2、10-3、10-4、10-5、10-6、10-7，每一号码设置三个重复，分别吸取各梯度稀释液0.1ml于相应平板中，用涂布棒涂布于无碳氮培养基平板，将涂布好的平板平放于桌上静置5～10min，待菌液渗透于培养基内后30℃倒置培养；48h后挑取形状不同的单菌落划线培养，其中单菌落为所筛选的微生物。
5.根据权利要求1所述的一种兼性固碳氮微生物的筛选方法，其特征在于：步骤(1)中的采样土壤为花生根际处土壤、豆类植物根际处土壤中的一种或两种的混合。
6.根据权利要求1所述的一种兼性固碳氮微生物的筛选方法，其特征在于：所述电子传递物质为硫化钠或硫代硫酸钠中的一种或两种的混合物。
7.根据权利要求1所述的一种兼性固碳氮微生物的筛选方法，其特征在于：所述无碳氮培养基的pH值为4.5～6.8。
8.根据权利要求1所述的一种兼性固碳氮微生物的筛选方法，其特征在于：步骤(4)中对于耐CO2、N2的菌还需用胶塞试管代替培养基平板进行筛选。
9.根据权利要求1所述的一种兼性固碳氮微生物的筛选方法，其特征在于：所述方法还可以用于固氮碳藻类微生物的筛选。
固碳氮微生物的培养基及固碳氮微生物的筛选方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及微生物技术领域，具体涉及固碳氮微生物的培养基及固碳氮微生物的筛选方法。
【背景技术】
[0002]目前，公知的微生物固碳菌、微生物固氮菌分别只能固定CO2和N2，在学术上和传统理论上固定N2的固氮菌和固定CO2的固碳菌分别早已被研究和发现。现有大量研究表明大自然中尤其是土壤中存在很多具有固碳功能的微生物，从微生物进化理论而言，微生物对环境的适应性强、变异快、代谢途径和
营养类型多样化，同时固定N2和CO2的微生物的存在不无可能，尤其是分布在豆科植物(不施氮肥为最佳选择)根部土壤中(当然也不排除别的生境可能也存在这类微生物)很多固氮菌中极有可能存在某些能同时具有固碳功能的微生物。另外，分布在水体尤其是深海中的一些固碳菌也极有可能存在某些能同时具有固氮功能的微生物。
[0003]《环境科学学报》第33卷第4期中的公开论文《一种能同时固定CO2和N2的微生物--兼性固CO2、N2菌的分离鉴定及其验证实验》，该论文用固氮或固碳的培养基中优化出兼性固氮碳微生物培养基来筛选兼性固氮碳细菌，但该电子传递中没有电子传递体，不易促进微生物的呼吸和生长，且该论文的兼性无氮碳培养基虽然能筛选细菌，也能用于筛选真菌和一些藻类微生物，但适应性不强，且在该培养基下细菌、真菌和藻类微生物生长慢，筛选周期长，且培养过程中的细菌、真菌和藻类微生物呼吸链易造成问题导致死亡。
【发明内容】
[0004]本发明的发明目的在于：针对上述存在的问题，提供提供一种固碳氮微生物的培养基及兼性固碳氮微生物的筛选方法，不仅可以筛选兼性固氮碳的细菌，而且可以筛选真菌和部分藻类微生物，同时本发明的兼性无氮碳培养基中增加了电子传递体还能促进微生物的呼吸和生长，微量元素的配制和添加也能进一步加速细菌、真菌和藻类微生物的生长，进一步提高了筛选的效率。
[0005]为了实现上述目的，本发明采用的技术方案如下：
[0006]固碳氮微生物的培养基，所述培养基的组成及重量为：KH2PO4 1.0～1.5g、K2HPO4 2.0～2.5g、MgSO4·7H2O 0.2～0.3g、NaCl 20～30g、CaCl2 0.01～0.02g、FeSO4 0.01～0.02g，电子传递物质2.0～3.0g、微量元素混合液2～3ml；
[0007]其中微量元素混合液中的溶质为：Na2MoO4·2H2O 1.68～1.70mg、H3BO3 0.4～0.5mg、ZnSO4·7H2O 1.0～1.5mg、MnSO4·5H2O 1.0～1.5mg、CuSO4·5H2O 7.0～8.0mg、CoCl2·6H2O 1.0～1.5mg、NiSO4·7H2O 1.0～1.5mg。
[0008]进一步地所述固碳氮微生物的培养基，所述培养基的组成及重量为：KH2PO4 1.1～1.4g、K2HPO4 2.1～2.4g、MgSO4·7H2O 0.24～0.28g、NaCl 22～28g、CaCl2 0.012～0.018g、FeSO4 0.012～0.018g，电子传递物质2.2～2.8g、微量元素混合液2.2～2.8ml；
[0009]其中微量元素混合液中的溶质为：Na2MoO4·2H2O 1.685～1.695mg、H3BO3 0.42～0.48mg、ZnSO4·7H2O 1.1～1.4mg、MnSO4·5H2O 1.1～1.4mg、CuSO4·5H2O 7.2～7.8mg、CoCl2·6H2O 1.1～1.4mg、NiSO4·7H2O 1.1～1.4mg。
[0010]根据权利要求1所述固碳氮微生物的培养基，所述培养基的组成及重量为：KH2PO4 1.25g、K2H
PO4 2.3g、MgSO4·7H2O 0.26g、NaCl 25g、CaCl20.015g、FeSO4 0.015g，电子传递物质2.5g、微量元素混合液2.5ml；
[0011]其中微量元素混合液中的溶质为：Na2MoO4·2H2O 1.69mg、H3BO3 0.45mg、ZnSO4·7H2O 1.3mg、MnSO4·5H2O 1.3mg、CuSO4·5H2O7.5mg、CoCl2·6H2O 1.25mg、NiSO4·7H2O 1.3mg。
[0012]根据以上培养基的配方，所述一种兼性固碳氮微生物的筛选方法，包括以下步骤：[0013](1)微生物的选择：
[0014]菌类采样方法：采样为离地表大于15cm的土壤3份，将三份土壤磨碎混匀后称取1g 加入至装有玻璃珠的三角瓶中，并在其中注入9～10ml无菌水，然后置于摇床28～30℃，120～150r/min振荡20～30min，充分混合配置成土壤悬浮液；
[0015](2)好氧驯化富集：采用排水换气法配气，将血清瓶装满水后，倒扣于水中，按混合气比例N2∶CO2∶O2＝8.5∶0.5∶1用针筒打入相应量的N2、CO2和O2，用封口膜封口；将无碳氮培养基注入血清瓶中，同时另一针头通过胶塞插入血清瓶中，以便排气；后将步骤(2)中的土壤悬浮液加入到装有无碳氮培养基的血清瓶中，然后置于摇床28～30℃，120～150r/min振荡20～30min，2～3d为一个富集周期，每个周期结束后重新充入混合气，比例N2∶CO2∶O2＝8.5∶0.5∶1，重复富集过程共2～3次得到菌液；
[0016](5)厌氧驯化富集：采用排水换气法配气，将血清瓶装满水后，倒扣于水中，将有氧气氛混合气即空气∶CO2＝9∶1的气体用针筒打入，用封口膜封口，将无碳氮培养基注入血清瓶中，同时另一针头通过胶塞插入血清瓶中，以便排气，将步骤(3)的菌液转接到新的装有无碳氮培养基的血清瓶中，然后置于摇床28～30℃，120～150r/min振荡20～30min，2～3d 为一个富集周期，培养一个周期后，再将无氧气氛混合气N2∶CO2＝9∶1用针筒打入血清瓶中，再以2～3d为一个富集周期，培养一个周期后，再在有氧气氛和无氧气氛条件下重复5～6个周期，最后得到目的菌液；
[0017](6)梯度平板分离：采用10倍梯度稀释方法将目的菌液制成悬液浓度为10-1、10-2、10-3、10-4、10-5、10-6、10-7，运用涂布平板培养法，先将无碳氮培养基倒入无菌平板中，待凝固后编号10-1、10-2、10-3、10-4、10-5、10-6、10-7，每一号码设置三个重复，分别吸取各梯度稀释液0.1ml于相应平板中，用涂布棒涂布于无碳氮培养基平板，将涂布好的平板平放于桌上静置5～10min，待菌液渗透于培养基内后30℃倒置培养；48h后挑取形状不同的单菌落划线培养，其中单菌落为所筛选的微生物。
[0018]进一步地，步骤(2)中的采样土壤为花生根际处土壤、豆类植物根际处土壤中的一种或两种的混合，很多研究表明大自然中尤其是土壤中很多微生物都有固碳功能，但不一定有固氮功能。固氮菌大多分布在豆科植物(不施氮肥为最佳选择)根部土壤中，这部分的固氮菌极有可能有些会同时具有固碳功能。
[0019]进一步地，所述电子传递物质为硫化钠或硫代硫酸钠中的一种或两种的混合物；因兼性固碳氮菌无碳氮培养基无电子传递体故加电子传递体，微生物利用游离的硫离子作
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