(19)中华人民共和国国家知识产权局
(12)发明专利申请
(10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请号 201811558120.8
(22)申请日 2018.12.19
(71)申请人 南京宸翔医药研究有限责任公司
地址 210000 江苏省南京市江宁区乾德路5
号生命科学创新中心4楼
(72)发明人 吴祖栋 杨丽 齐炼文 邢宸
邢为藩
(74)专利代理机构 北京高沃律师事务所 11569
代理人 刘奇
(51)Int.Cl.
C07H 17/07(2006.01)
C07H 1/08(2006.01)
A61K 31/7048(2006.01)
A61P 39/06(2006.01)
A61P 9/10(2006.01)
A61P 1/16(2006.01)A61P 3/06(2006.01)A61P 7/04(2006.01)A61P 37/04(2006.01)
(54)发明名称一种荷叶黄酮苷的提取方法以及包括荷叶黄酮苷的药物制剂(57)摘要本发明提供了一种荷叶黄酮苷的提取、纯化方法以及包括荷叶黄酮苷的制剂，属于中药提取技术领域，所述方法包括以下步骤：将荷叶粉加60～80℃的水，搅拌提取，分离提取液和滤渣，提取3次，甩滤液放冷至室温，调节pH为2-3，放置2h，经错流过滤，得精滤液；调节精滤液的pH为5～6.5，用大孔树脂吸附、洗涤、洗脱，收集荷叶黄酮苷纯度≥99％的洗脱液，完成荷叶黄酮苷的提取、纯化；本发明中提纯获得的荷叶黄酮苷为槲皮素-3-O -β-D葡萄糖醛酸苷，其中槲皮素-3-O -β-D葡萄糖醛酸苷的纯度大于99.22％，收率高，成本低。本发明所述提取方法简便快捷，提取工艺能够实现自动化、智能化、绿化和数字化量 化。权利要求书1页 说明书9页 附图5页CN 109467581 A 2019.03.15
C N 109467581
A
1.一种荷叶黄酮苷的提取方法，包括以下步骤：
1)将荷叶粉与60～80℃的水混合，进行第一次搅拌提取，第一次甩滤，获得滤液1和滤渣1；
2)将所述滤渣1与60～80℃水混合，进行第二次搅拌提取，第二次甩滤，获得滤液2和滤渣2；
3)将所述滤渣2与60～80℃水混合，进行第三次搅拌提取，第三次甩滤，获得滤液3和滤渣3；
4)合并所述滤液1、滤液2和滤液3，冷至25～30℃后，调pH为2～3，放置2h，错流过滤，得到精滤液；
5)调节所述精滤液的pH值为5～6.5后，用大孔树脂吸附、洗涤、洗脱，收集荷叶黄酮苷纯度≥99％的洗脱液完成荷叶黄酮苷的提取与纯化；
所述荷叶黄酮苷为槲皮素-3-O -β-D葡萄糖醛酸苷。
2.根据权利要求1所述的提取方法，其特征在于，步骤1)中所述荷叶粉与水的质量比为1：(7～10)。
3.根据权利要求1或2所述的提取方法，其特征在于，步骤2)中所述滤渣1和步骤3)中所述滤渣2与水的质量比独立为1：(5～8)。
4.根据权利要求1所述的提取方法，其特征在于，步骤1)中所述第一次搅拌提取的时间为12～18min。
5.根据权利要求4所述的提取方法，其特征在于，步骤2)中所述第二次搅拌提取或步骤
3)中所述第三次搅拌提取的时间独立为5～10min。
6.根据权利要求1所述的提取方法，其特征在于，所述步骤5)收集洗脱液后还包括调节所述洗脱液的pH值为1.5～3.5，用大孔树脂吸附法富集、用纯化水和30％乙醇洗涤，再以体积浓度50～95％的乙醇溶液洗脱实现浓缩。
7.权利要求1～6任意一项所述提取方法提取获得的荷叶黄酮苷，其特征在于，所述荷叶黄酮苷中槲皮素-3-O -β-D葡萄糖醛酸苷的纯度≥99％。
8.一种包括权利要求7所述荷叶黄酮苷的药物制剂，所述药物制剂具有降脂、抗肝纤维化、止血散瘀、增强免疫的功能。
权 利 要 求 书1/1页CN 109467581 A
一种荷叶黄酮苷的提取方法以及包括荷叶黄酮苷的药物制剂
技术领域
[0001]本发明属于中药提取与应用技术领域，尤其涉及一种荷叶黄酮苷的提取方法以及包括荷叶黄酮苷的药物制剂。
背景技术
[0002]睡莲科植物莲(Nelumbonuciferaei Gaertn)在中国多地都有种植，以江苏、浙江、安徽等省种植广泛，既可观赏，又可食用，也可药用的植物，在医药、食品、保健品等行业都有应用。荷叶中含黄酮、生物碱、多酚、挥发油、甾类、萜类、脂肪酸、脂肪醇、蛋白质、单宁等百余种化学成分，黄酮类和生
物碱类化合物是其主要的药理活性成份。黄酮类有单葡萄糖醛酸苷(槲皮素-3-O-β-D-葡萄糖醛酸苷，Q3GA)、双葡萄糖醛酸苷(槲皮素-3-O-β-D-双葡萄糖醛酸苷)，金丝桃苷(槲皮素-3-O-β-D-吡喃半乳糖苷)、异槲皮苷(异槲皮素-3-O-β-D-葡萄糖苷)和紫云英苷(莰非醇-3-O-葡萄糖苷、山柰酚-3-葡萄糖苷)等约30种，余为多酚、挥发油等。目前，荷叶供大于求，使用量较少，且荷叶在医药、食品、保健品等行业的应用还处在比较初始阶段，开发的广度与深度远不能适应时代的需求。如何开发荷叶新用途，特别是用于多发病和某些重大疾病的防治，是药学工作者的使命。
[0003]荷叶为睡莲科植物莲的干燥叶，性平味苦，无毒(小鼠的LD50＞5g/kg)，具有清解暑邪、轻宣透邪、升清降浊、醒脾开胃、止血散瘀的功效。荷叶黄酮苷用于降脂减肥、抗氧化、清除自由基、抗衰老、保肝和抑制肝纤维化、抗肝毒、抗菌消炎等，入心、肝、胆、脾、胃经。历代医书中多有记载，明代戴元礼的《秘传证治要决》中对于荷叶减肥功效记载：“荷叶服之，令人瘦劣”。《本草拾遗》中亦云：“久食令人瘦”。随着人民生活水平的提高，日摄入脂肪、糖的量日益增加，冠心病、AD症、高血脂、肥胖症患者也日渐增加，对药学研究工作者也提出了更高要求，降脂、物研发日益迫切。
[0004]给高脂血症模型大鼠、小鼠灌胃单味荷叶水提取物的降脂减肥研究，观察对血清胆固醇及甘油三脂的影响，结果显示：荷叶水能使高脂血症大鼠的TC下降25.6％～39.3％，TG下降18.9％～39.2％，对HDL-C未见明显影响，但随TC、TG的降低，低密度脂蛋白胆固醇(LDL-C)显著下降，同时荷叶水煎剂能降低全血比黏度、红细胞压积(％)，从而改善血液浓粘状态。荷叶黄酮对高胆固醇表现出明显的抑制
作用；体外培养肝细胞合成TC实验显示：荷叶黄酮在使肝细胞内TC降低的同时又使培养液TC明显升高。其作用主要表现在促进脂类代谢方面，对其合成的抑制作用较弱。主要活性部位集中在黄酮上，动物活动正常，无明显腹泻和抑制食欲的现象发生。
[0005]近年来，许多药学工作者对荷叶中有效组分的提取、纯化及其质量、剂型、新适应症和作用机制等研究日益关注。但现有的荷叶黄酮苷提取方法，或提纯工艺较繁琐冗长，费时费事，生产成本高，或产品纯度不高，或收率较低，均不尽人意，尚无规模化生产。
发明内容
[0006]有鉴于此，本发明的目的在于提供一种提取方法简单、成本低，提取收率高、获得
产品纯度高的荷叶黄酮苷的提取方法及包括荷叶黄酮苷的药物组合物。
[0007]基于上述发明目的，本发明提供了以下技术方案：
[0008]一种荷叶黄酮苷的提取方法，包括以下步骤：1)将荷叶粉加60～80℃的水，进行第一次搅拌提取，第一次甩滤，获得滤液1和滤渣1；2)将所述滤渣1加60～80℃水，进行第二次搅拌提取，第二次甩滤，获得滤液2和滤渣2；3)将所述滤渣2加60～80℃水，进行第三次搅拌提取，第三次甩滤，获得滤液3和滤渣3；4)合并所述滤液1、滤液2和滤液3，放冷至25～30℃，调节pH为2-3，放置2h，经错流过滤，
得精滤液；5)调节所述精滤液的pH值为5～6.5后，用大孔树脂吸附、洗涤、洗脱，收集荷叶黄酮苷纯度≥99％的洗脱液，完成荷叶黄酮苷的提取与纯化；所述荷叶黄酮苷即是槲皮素-3-O-β-D葡萄糖醛酸苷。
[0009]优选的，步骤1)中所述荷叶粉与水的质量比为1：(7～10)。
[0010]优选的，步骤2)中所述滤渣1和步骤3)中所述滤渣2与水的质量比独立为1：(5～8)。
[0011]优选的，步骤1)中所述第一搅拌提取的时间为12～18min。
[0012]优选的，步骤2)中所述第二搅拌提取或步骤3)中所述第三搅拌提取的时间独立为5～10min。
[0013]优选的，所述5)收集洗脱液后还包括调节所述洗脱液的pH值为1.5～3.5，用纯化水和30％乙醇洗涤，再以体积浓度50～95％的乙醇溶液洗脱实现浓缩。
[0014]本发明还提供了上述方法提取获得的荷叶黄酮苷，所述荷叶黄酮苷即为槲皮素-3-O-β-D葡萄糖醛酸苷的纯度≥99％。
[0015]本发明还提供了包括上述荷叶黄酮苷的药物制剂。
[0016]本发明提供的荷叶黄酮苷的提取方法，荷叶粉通过三次搅拌提取甩滤，得粗滤液放冷至室温，调p
H2-3，放置2h，经错流过滤得精滤液，调节精滤液的pH为5-6.5，过大孔树脂吸附、洗涤、洗脱，得荷叶黄酮苷即槲皮素-3-O-β-D葡萄糖醛酸苷，其纯度高≥99％；本发明所述提取方法简便快捷，提取工艺能够实现自动化、智能化、绿化和数字化量化，相对于其他提取需多次过树脂柱或不同填料柱分离纯化的方法，能显著节能减排，省时省事，省厂房省设备，提高收率，降低成本，产物的质量稳定可控，便于工业化生产。
[0017]进一步的，采用甩滤和错流过滤联用的方法进行过滤，提高过滤速度的同时，而且实现精密过滤。
[0018]进一步的，本发明所述提取方法通过各个步骤参数设定，实现全过程质量在线控制体系，解决了生产的产品批内均一性和批间重复性差异大的问题，从根本上保证了产品质量稳定可控。
附图说明
[0019]图1为未分离纯化的荷叶粉的HPLC指纹图谱图；
[0020]图2为荷叶黄酮苷(Q3GA)对照品的HPLC图；
[0021]图3为实施例1中荷叶黄酮苷(Q3GA)的HPLC图；
[0022]图4为荷叶黄酮苷(Q3GA)溶剂的HPLC图；
[0023]图5为实施例4中荷叶黄酮苷(Q3GA)的HPLC图。
具体实施方式
[0024]本发明提供了一种荷叶黄酮苷的提取、纯化方法，包括以下步骤：1)将荷叶粉加60～80℃的水搅拌提取，第一次甩滤，得粗滤液1和滤渣1；2)将所述滤渣1加60～80℃水搅拌提取，第二次甩滤，得粗滤液2和滤渣2；3)将所述滤渣2再加60～80℃水搅拌提取，第三次甩滤，得粗滤液3和滤渣；所述滤渣可制沼气和绿肥；4)合并粗滤液1、2、3，放冷至室温，调节pH 为2-3放置2-3h，经错流过滤，得精滤液，完成提取；5)调节所述精滤液的pH值为5～6.5后，用大孔树脂吸附、洗涤和洗脱，收集荷叶黄酮苷纯度≥99％的洗脱液，完成荷叶黄酮苷的纯化；所述荷叶黄酮苷即是槲皮素-3-O-β-D葡萄糖醛酸苷。
[0025]在本发明中，将荷叶粉与水混合进行首次搅拌提取。在本发明中，所述荷叶粉与水的质量比优选为1：(7～10)，更优选为1：(8～9)；所述首次搅拌提取的时间优选为12～18min，更优选为13～17min，最优选为15min。本发明中所述水的温度优选为60～80℃，具体可选为65～79℃、68～75℃、70～73℃、69℃、71℃或78℃；本发明中所述首次搅拌提取的料液温度优选为55～60℃。本发明对所述荷叶粉的来源和粒度没有特殊限定，通常采用荷叶中粉即可，本发明对所述水没有特殊限定，采用本领域常规提取用纯化水即可。
[0026]本发明在获得滤渣1后，加60～80℃水，进行第二次搅拌提取。在本发明中，所述滤渣1与水的质
量比优选为1：(5～8)，更优选为1：(6～7)。本发明中所述第二次搅拌提取的时间优选为5～10min，更优选为6～9min，最优选为8min。本发明中所述水的温度优选为60～80℃，具体可选为65～79℃、68～75℃、70～73℃、69℃、71℃或78℃；本发明中所述第二次搅拌提取的实际温度优选为55～60℃。本发明所述第二次搅拌提取后，进行第二次过滤获得滤液2和滤渣2。
[0027]本发明在获得滤渣2后，再次加水，进行第三次搅拌提取。其渣：水之比，提取时间，水的温度，实际料液温度等主要参数与操作均与第二次提取相同。本发明所述提取中渣-液粗分离可以用甩滤或压滤，优选的是甩滤，简便快捷。
[0028]本发明对所述三次搅拌提取过程中搅拌的转速没有特殊限定，根据具体设备的可能设定，以快为好，搅拌有利活性成分的溶出。一般实验室小设备，几百转/min，对于生产设备和搅拌器的类型不同，转速多在30-60转/min之间。
[0029]本发明对所述甩滤液1-3合并后方冷至室温，调节pH为2-3，放置2h经错流过滤精滤得精滤液，甩滤是精滤的预滤，没有甩滤就无法精滤，精滤才是目标过滤。
[0030]本发明所述精滤液应调节其pH为5～6.5后，过大孔树脂吸附、梯度洗地、洗脱，收集荷叶黄酮苷纯度≥99％的洗脱液，至此，完成中药提取液的分离纯化。本发明对调节精滤液用的试剂没有特殊限定，常用的为盐酸和氢氧化钠，浓度应需要而定。在本发明中，所述大孔树脂的型号优选为FL-2、SP-3
、D101或D301；所述大孔树脂柱的径高比优选为1:8～33；本发明中所述精滤液的上样流速优选为1～2BV/h，更优选为1.5BV/h。本发明在所述精滤液上样后，进行梯度洗涤、洗脱。本发明所述洗脱前，优选的还包括洗涤步骤，尤其是制备注射用原料，所述洗涤优选的为用体积分数0～12％乙醇梯度洗涤后，再以本发明中所述洗脱用溶液优选为体积浓度15～25％的乙醇水溶液洗脱后，收集荷叶黄酮苷纯度≥99％的洗脱液，至此，即完成荷叶黄酮苷的提取与分离纯化，采用本发明所述的方法经过一次大孔树脂吸附即可完成荷叶黄酮苷的分离纯化。
[0031]本发明在收集所述稀洗脱液后，优选的还包括调节所述洗脱液的pH值为1.5～
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