(19)中华人民共和国国家知识产权局
(12)发明专利申请
(10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请号 201810967804.7
(22)申请日 2018.08.23
(83)生物保藏信息
CGMCC No.7996 2013.08.13
(71)申请人 华南农业大学
地址 510642 广东省广州市天河区五山路
483号
(72)发明人 廖美德 舒灿伟 胡亮亮 赵鹏飞
郑文博
(74)专利代理机构 广州粤高专利商标代理有限
公司 44102
代理人 任重
(51)Int.Cl.
C07D 487/04(2006.01)
A01P 3/00(2006.01)
C12P 17/18(2006.01)C12R 1/01(2006.01) (54)发明名称
上的应用
(57)摘要
本发明公开了一种克里本类芽孢杆菌代谢
物及其在生防上的应用。所述克里本类芽孢杆菌
具有较强的广谱抗真菌活性，尤其是对水稻纹枯病菌、玉米小斑病菌、玉米大斑病菌等植物病原真菌具有显著的抑菌活性，可大规模生产以用于防治植物病害，在防治水稻纹枯病、玉米小斑病和玉米大斑病等植物真菌病害方面，以及制备相应生防菌剂方面， 具有很好的开发应用前景。权利要求书1页 说明书8页 附图3页CN 109265461 A 2019.01.25
C N 109265461
A
1.一种抑菌化合物，其特征在于，其结构式如下式（I ）
所示：
。
2.权利要求1所述化合物在抑制植物真菌病原或防治植物真菌病害方面的应用。
3.权利要求1所述化合物在制备植物真菌病原抑菌剂或植物真菌病害生防制剂方面的应用。
4.根据权利要求2或3所述的应用，其特征在于，所述植物真菌为水稻纹枯病菌、玉米小斑病菌、玉米大斑病菌、水稻稻瘟病菌、香蕉枯萎病菌、辣椒菌或灰葡萄孢菌。
5.一种植物真菌病害生防制剂，其特征在于，该生防制剂的活性成分包含权利要求1所述抑菌化合物。
6.权利要求1所述化合物的制备方法，其特征在于，以组成为蔗糖、NaNO 3和K 2HPO 4的基础培养基对克里本类芽孢杆菌进行培养，从培养代谢产物中分离鉴定得到抑菌活性高的单体化合物。
7.根据权利要求6所述的制备方法，其特征在于，所述基础培养基的配方为：2～4% 蔗糖、0.1～0.2% NaNO 3、0.05～0.15% K 2HPO 4。
8.根据权利要求6所述的制备方法，其特征在于，所述克里本类芽孢杆菌为克里本类芽孢杆菌TRCC82001，该菌株于2013年8月13日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，其保藏号为：CGMCC No.7996。
9.根据权利要求6所述的制备方法，其特征在于，克里本类芽孢杆菌的培养条件为：初始pH 7～8，温度28～32℃，转速150～220 r/min，80～120 mL/1000mL (v/v)摇瓶发酵培养72～96h。
10.根据权利要求6所述的制备方法，其特征在于，克里本类芽孢杆菌的培养产物使用乙醇沉淀多糖，使多糖析出，然后再离心除去菌体及胞外多糖，再依次经过大孔吸附树脂层析、硅胶柱层析、反相C -18柱层析，分离得到具有抑菌活性的单点馏分，鉴定得到所述抑菌化合物。
权 利 要 求 书1/1页CN 109265461 A
一种克里本类芽孢杆菌代谢物及其在生防上的应用
技术领域
[0001]本发明属于生物防治技术领域，更具体地，涉及一种克里本类芽孢杆菌代谢 物及其在生防上的应用。
背景技术
[0002]联合国粮农组织(FAO)调查统计称，每年世界粮食因杂草危害损失达11％、 因鼠类危害损失达20％、因害虫危害损失达14％、因病害危害损失达10％。化 学农药是解决粮食生产过程中病、虫、草、鼠害的主要措施，但随着化学农药的 过量使用，对环境生态、土壤结构和微生物多样性等产生了不利的影响，另外， 植物病原菌对不少品种已产生了严重的抗性，化学农药的使用越来越受限制。目 前，我国正在推广植物生产过程中“减肥减药”的技术，这是当前植物保护领域的 热门方向。“减药”主要指的就是减少化学农药的使用，因此，生物农药由于具有 环保、高效、低毒、低残留以及与环境相容性好等特点，越来越受到重视，迫切 需要开发具有不同作用机理的、安全、有效、环保的生防制剂。
[0003]植物病害生物防治的概念最早于1965由英国植物病理学家Garrat提出，是 指通过除人以外的一种或多种生物来降低病原物数量或减弱病原的致病活力，从 而减少病原物所致病害的发生。寄主植物周围不仅存在病原菌，而且还存在着大 量的非病原菌，其中有的是病原菌的拮抗微生物。这些拮抗微生物可通过与病原 菌的抗生作用、竞争作用、重寄生作用及诱导植物产生系统抗性等机理来抑制病 原菌，达到防治植物病害的目的。此外，拮抗微生物对环境安全，不会像化学农 药那样造成环境污染以及对人畜
产生毒害，同时拮抗微生物不易使病原菌产生耐 药性，有些还具有促进植物生长的作用，且实际生产工艺简单，因此，利用拮抗 微生物防治病害的研究正越来越受到国内外科研机构的重视。目前，人们已经分 离到多种对不同植物病害有不同程度防治效果的拮抗微生物，其中有些已经进入 实际应用阶段，产生了巨大的社会效益和环境效益。拮抗微生物(真菌、细菌、 放线菌等)的生防机制主要有竞争、抗生、重寄生、交叉保护和诱导植物抗性等 方面。一种微生物作用机制可以有多种，不同微生物作用机制可能有所不同，它 们的相对重要性随生防因子的种类及根际理化条件和生物条件而异。
[0004]而拮抗微生物的抗生作用主要是抗菌代谢产物的杀菌作用，抗菌代谢产物在 目前的植病生防菌的筛选中是第一位的重要指标，产生抗菌代谢产物与否及其产 量大小往往决定着一个生防菌株的命运，代谢产物包括抗生素、细菌素、几丁质 酶、葡聚糖酶等。木霉菌作为拮抗真菌的代表在产生抗菌物质方面具有优势，就 其种类而言，仅抗真菌的代谢产物至少在70种以上。细菌产生抗菌物质的属主 要集中在假单胞菌属(Pseudomonas)、芽孢杆菌属(Bacillus)中。据统计由枯草芽 孢杆菌产生的抗菌物质达20多种，主要为多肽类物质，部分为具有特殊结构的 蛋白类物质，如结合有多糖、磷脂蛋白。
[0005]类芽孢杆菌属是1994年从芽孢杆菌中分出的一个新属，模式菌为多粘类芽 孢杆菌(Paenibacilluspolymyxa)。多粘类芽孢杆菌自在日本发现以后得到了广泛 的研究，其中有些菌株可以产生多粘菌素，其主要成分为A、B、C、D、E五种 成分，B、E两种成分已在医药
领域得到广泛的应用，为人类健康做出了重要的 贡献。而目前，对于类芽孢杆菌属的研究主要集中在优良菌株的选育和通过发酵 或基因工程的手段提高活性物质的产量，对于克里本类芽孢杆菌(Paenibacillus kribbensis)代谢物的活性物质的纯化、鉴定和在防治植物真菌病害中的应用尚未 见报道，仍具有很大的不足和研究空间。
发明内容
[0006]本发明要解决的技术问题是克服现有应用化学农药防治植物真菌病害的缺 陷和不足，从克里本类芽孢杆菌代谢物中纯化鉴定得到一种具有广谱抑真菌活性 的化合物，在防治植物真菌病害方面具有很好的应用前景。
[0007]本发明目的是提供一种从克里本类芽孢杆菌代谢物中分离纯化的抑菌化合 物。[0008]本发明另一目的是提供一种生防制剂。
[0009]为了实现上述目的，本发明是通过以下方案予以实现的：
[0010]一种抑菌化合物，其分子式为C12H10N4O2，分子量为242.96，结构式如下式 (I)所示：
[0011]
[0012]该化合物对水稻纹枯病菌、玉米大斑病菌、玉米小斑病菌等植物真菌病害均 具有很好的抑菌活性，因此，所述化合物在抑制植物真菌病原或防治植物真菌病 害方面的应用，以及在制备植物真菌病原抑菌剂或植物真菌病害生防制剂方面的 应用，均应在本发明的保护范围之内。
[0013]具体优选地，所述植物真菌为水稻纹枯病菌、玉米小斑病菌、玉米大斑病菌、 水稻稻瘟病菌、香蕉枯萎病菌、辣椒菌或灰葡萄孢菌等。
[0014]所述植物真菌病害包括水稻纹枯病、玉米小斑病和玉米大斑病等。
[0015]一种包含所述抑菌化合物的植物真菌病害生防制剂，也应在本发明的保护范 围之内。
[0016]另外，本发明还提供了一种制备所述抑菌化合物的方法：是以组成为蔗糖、 NaNO3和K2HPO4的基础培养基对克里本类芽孢杆菌进行培养，从培养代谢产物 中分离鉴定得到抑菌活性高的单体化合物。
[0017]优选地，所述基础培养基的配方为：2～4％蔗糖、0.1～0.2％NaNO3、0.05～ 0.15％K2HPO4。
[0018]更优选地，所述基础培养基的配方为：3％蔗糖、0.15％NaNO3、0.1％ K2HPO4。[0019]优选地，所述克里本类芽孢杆菌的分类命名为：克里本类芽孢杆菌 Paenibacillus kribbensis，菌株为：TRCC82001，该菌株于2013年8月13日保藏 于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，其保藏编号为：CGMCC No.7996，保藏地址为：北京市朝阳区北辰西路1号院3号。
[0020]优选地，克里本类芽孢杆菌的培养条件为：初始pH 7～8，温度28～32℃， 转速150～220r/min，80～120mL/1000mL(v/v)摇瓶发酵培养72～96h。
[0021]更优选地，克里本类芽孢杆菌的培养条件为：初始pH 7～8，温度30℃，转 速180r/ min，100mL/1000mL(v/v)摇瓶发酵培养84h。
[0022]最后，克里本类芽孢杆菌的培养产物使用乙醇沉淀多糖，使多糖析出，然后 再离心除去菌体及胞外多糖，再依次经过大孔吸附树脂层析、硅胶柱层析、反相C-18柱层析，分离得到具有抑菌活性单点馏分，鉴定得到所述抑菌化合物。
[0023]另外具体地，作为一种可选择的实施方案，所述抑菌化合物的制备方法包括 以下步骤：
[0024](1)克里本类芽孢杆菌的培养
[0025]以上述基础培养基对克里本类芽孢杆菌进行培养，并调节培养基的pH为7～ 8，置于温度为30℃，转速为180r/min的培养条件下，进行100mL/1000mL(v/v) 摇瓶发酵培养84h；
[0026](2)培养产物的预处理
[0027]发酵结束后，使用乙醇沉淀多糖，使多糖析出，然后再离心除去菌体及胞外 多糖；[0028](3)克里本类芽孢杆菌代谢物的分离
[0029]先用大孔吸附树脂层析，再用硅胶柱层析，最后用反相C-18柱层析，分离 得到单点馏分，利用TCL生物自显影法测定馏分的抑菌活性，对克里本类芽孢 杆菌代谢物进一步的鉴定。
[0030]更具体地，步骤(2)的具体步骤为：发酵结束后，加入等体积的乙醇，剧 烈震荡使乙醇与发酵液充分接触，并静置一夜使菌体分泌的多糖充分析出，低温 冷冻离心除去析出的多糖，得到清亮的发酵液；再利用旋转蒸发仪进行减压蒸馏 浓缩，除去多余的水分；当发酵液比较黏稠时，再加入等体积的乙醇，再除一次 多糖，重复3～5次，最后浓缩得到多糖含量较少的发酵粗提物。
[0031]步骤(3)的具体步骤为：
[0032]1)先用大孔吸附树脂层析，通过梯度洗脱，采用TLC-生物自显影跟踪检测 代谢物活性，具有活性的洗脱液在60℃水浴中真空减压浓缩至干，待下一步继 续分离纯化；[0033]2)再用硅胶柱进行层析，通过梯度洗脱，采用TLC-生物自显影跟踪检测活 性，具有活性的洗脱液在60℃水浴中真空减压浓缩至干，待下一步继续分离纯 化；
[0034]3)再用反相C-18柱进行层析，先用纯水洗脱，然后逐渐增加甲醇比例进行 梯度洗脱，最终分离得到一个单一的点，用于进一步鉴定。
[0035]对以上沉淀富集的单点馏分进行结构研究，得到一个具有较强抑菌活性的化 合物，该化合物为淡黄晶体，极性高，能溶于水和DMSO，微溶于甲醇，分 子式为C12H10N4O2，分子量为242.96。
[0036]与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：
[0037]本发明从克里本类芽孢杆菌TRCC82001中分离、鉴定出了一种具有较强抑 菌活性代谢物，明确了该代谢物的化学结构和分子式，同时发现该代谢物对植物 病原真菌具有较强的抑菌作用，对水稻纹枯病、玉米小斑病和玉米大斑病等的防 治效果显著，为生防制剂的开发应用提供了良好的依据。
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