(19)中华人民共和国国家知识产权局
(12)发明专利申请
(10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请号 201810394691.6
(22)申请日 2018.04.27
(71)申请人 株式会社岛津制作所
地址 日本京都府
(72)发明人 郭彦丽 滨田尚树 端裕树
(74)专利代理机构 北京林达刘知识产权代理事
务所(普通合伙) 11277
代理人 刘新宇 李茂家
(51)Int.Cl.
G01N 30/60(2006.01)
(54)发明名称
(57)摘要
本发明涉及一种快速检测油脂或生物样品
中的维生素D的方法，本发明中，将待测样品使用
多维谱系统进行维生素D样品的在线预处理和
液相谱部分中包括一个或一个以上的反相液
相谱柱；所述超临界谱部分包括超临界流动
相、
改性剂和超临界用填料柱。权利要求书2页 说明书13页 附图5页CN 110412189 A 2019.11.05
C N 110412189
A
1.一种快速检测油脂或生物样品中的维生素D的方法，其特征在于，所述方法包括如下步骤：
S1：待测样品的制备；
S2：将待测样品使用多维谱系统进行维生素D的分离；
其中，所述多维谱系统包括依次连接的超临界谱部分及反相液相谱部分，所述反相液相谱部分中包括一个或一个以上的反相液相谱柱；
所述超临界谱部分包括超临界流动相以及改性剂，所述改性剂选自醇类物质、腈类物质或它们的水溶液，优选为甲醇或其水溶液；
S3：检测由S2步骤分离得到的维生素D。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述超临界谱部分包括一个超临界谱柱；所述反相液相谱部分中包括两个反相液相谱柱。
3.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于，所述多维谱系统中的谱柱通过多通阀组进行连接。
4.根据权利要求1-3中任一项所述的方法，其特征在于，所述超临界谱部分中：
固定相选自极性基团改性的硅胶，所述极性基团选自羟基、氨基或氰基，优选地，所述改性的硅胶选自二醇基硅胶；
流动相为超临界二氧化碳。
5.根据权利要求1-4中任一项所述的方法，其特征在于，所述反相液相谱部分中：
固定相选自疏水基团改性的硅胶，所述疏水基团选自烃基，优选地，所述改性的硅胶优选自C18-硅胶；
所述流动相为极性有机溶剂或其水溶液。
6.根据权利要求1-5任一项所述的方法，其特征在于，所述反相液相谱部分的反相液相谱柱相同或不同。
7.根据权利要求1-6中任一项所述的方法，其特征在于，在S2步骤中，被超临界谱部分吸附的弱极性物质仅在所述改性剂的作用下被输送到反相液相谱部分中，并在该反相液相谱部分中去除从超临界谱部分中流出的超临界流动相。
8.根据权利要求1-8中任一项所述的方法，其特征在于，S2步骤中，包括如下步骤：
S21：使用超临界谱柱对待测样品进行成分分离，并将弱极性物质输送到反相液相谱柱中；
S22：在反相液相谱柱中，将从超临界谱柱中流出的超临界流动相去除；
S23：在上述反向液相谱柱中，进一步通入流动相，将存在于反相液相谱柱中的物质进行分离，得到分离出的维生素D组分；
任选地，S21步骤中所述将弱极性物质输送到反相液相谱柱中与S22步骤同步进行。
9.根据权利要求1-8中任一项所述的方法，其特征在于，S2步骤中，包括如下步骤：
S21’：使用超临界谱柱对样品进行成分分离，将弱极性物质输送到反相液相谱部分的第一反相液相谱柱中；
S22’：在第一反相液相谱柱中，将从超临界谱柱中流出的超临界流动相去除；
S23’：在第一反相液相谱柱中，进一步通入流动相将存在于该谱柱中的弱极性物质输送到第二反相液相谱柱中，在所述第二反相液相谱柱中分离得到维生素D组分；
任选地，S21’步骤中所述将弱极性物质输送到第一反相液相谱柱中与S22’步骤同步进行。
10.根据权利要求1-9中任一项所述的方法，其特征在于，在S2步骤前，还包括使用前处理谱柱分离待测样品中的蛋白成分的步骤；S3步骤中，使用质谱仪器进行检测。
一种快速检测油脂或生物样品中的维生素D的方法
技术领域
[0001]本发明涉及一种从油脂或生物样品中维生素的分离、检测方法和系统，属于天然物质的分离领域。
背景技术
[0002]维生素D2(也被称为麦角钙化醇)和维生素D3(胆钙化醇)是脂溶性维生素，它们在钙代谢中起着非常重要的作用。维生素D也影响其他代谢途径。缺乏维生素D可导致严重的疾病，如佝偻病和骨骼减弱。通常，使用维生素D补充剂用于或预防维生素缺乏症。维生素D也被添加到婴儿配方奶粉，以满足婴儿的营养需求。但值得注意的是，过量摄入维生素D 也可能是危险的。因此，在维生素补充剂和婴儿配方食品中合适地使用维生素D在医疗和保健上都起着非常重要的作用。
[0003]由于维生素D含量较低，易受基质干扰，因此在检测前，样品溶液制备过程通常包括皂化、萃取等步骤。传统上，维生素D测定的现有程序一般需要使用溶剂从油性或脂肪基质中萃取，然后通过正相液相谱(NPLC)进行清洁，进而经过反相液相谱柱(RPLC)进行分离和检测。由于传统的基于溶剂的提取技术首先是耗时，也需要密集的劳动，并且消耗了大量的有机溶剂，因此也进行了许多尝试，以简化的样品制备过程。
[0004]为了分析婴儿配方奶粉中的维生素D，开发了两种反相液相谱的二维柱切换系统用于在线清除提取物。引用文献1公开了一种在线二维液相谱法同时测定婴幼儿和成人配方营养品中的维生素A、D
3和E的方法，其一维和二维分离均基于反相谱。样品经过皂化、萃取后，直接进样分析，一次进样即可在线完成样品中各维生素的定量分析。但是，使用RPLC清洗从油状物或脂质的基体中提取的样品的过程会使得一些强疏水性的脂溶性杂质保留在RPLC柱中。杂质积累在谱柱中，不仅会导致检测物保留时间的改变，而且还会导致清洁柱的寿命缩短。
[0005]在另一方面，高效液相谱法/超高效液相谱-质谱(HPLC/UPLC-MS)使用更加简单的样品制备方法已被开发用于在油性维生素补充剂、婴儿配方奶粉或生物流体中的维生素D分析。但是，通常情况下这样的方法仍然需要离线溶剂萃取过程或正相固相萃取(SPE)处理以对样品进行预处理或成分清理。引用文献2涉及利用UPLC-MS/MS建立了一种快速、灵敏的、能够同时测定婴幼儿配方奶粉中脂溶性维生素A、D2、D3、α-生育酚的分析方法。但对于检测样品，仍然需要经过碱性无机物的处理以及有机溶剂的提取，在前处理的简便性方面还有改进或提高的余地。
[0006]此外，为了获得高效率的自动分析系统，仍然需要基于正相液体在线纯化油性或脂肪样品的谱法。然后，可以使用反相液相谱分析分离较少的脂肪洗脱液以提供更好的分辨率。然而，由于两种不同类型的流动相的不匹配性，难以构建柱切换系统以同时包括正相和反相液相谱。
[0007]此外，随着超临界流体技术的发展，也尝试了使用超临界萃取或超临界谱分析法对物质进行提取或分离。在超临界技术中对于维生素D分离和分析中具有与NPLC相类似
的保留时间和分离行为。引用文献3公开了用柱谱从与其它组分如脱氢胆固醇，速甾醇和光甾醇的混合物中分离维生素D3或前维生素D3的方法，所述谱柱中的流动相为超临界二氧化碳。但是该方法仅涉及合成维生素D产品后的分离或提纯。
[0008]可见，在现有技术中，对于从油脂或生物样品等成分复杂的体系中提取维生素D的方法在应用的便捷性、环保型、快速性等方面的改进不能说是充分的。
[0009]引用文献1：
[0010]“在线二维液相谱法同时测定婴幼儿和成人配方营养品中的维生素A、D3和E”，《谱》，2015年3月
张艳海，
[0011]引用文献2：
[0012]“超高效液相谱/超临界流体谱-串联质谱联用技术同时测定婴幼儿配方乳粉中多种维生素的研究”，全思思，广东药科大学硕士学位论文，2017年
[0013]引用文献3：CN1144782C
发明内容
[0014]发明要解决的问题
[0015]针对上述现有技术中对于从油脂或生物样品等成分复杂的体系中提取维生素D的方法所面临的前处理过程复杂、溶剂消耗量大、各谱分析之间切换缺少便利性等问题，本发明采用多维谱系统，提供了一种快速检测油脂或生物样品中的维生素D的方法和检测系统，其使用超临界谱与反相液相谱联用，能够实现简便、快速的对油脂或生物样品中含有的维生素D进行分离，进而使用检测仪器对分离得到的维生素D进行检测分析。[0016]本发明的方法和分析系统，允许在不同谱柱之间进行便捷、快速的切换，进而实现了快速、准确地检测维生素D。
[0017]用于解决问题的方案
[0018]本发明中，使用如下方案解决了上述技术问题：
[0019]本发明首先提供了[1]一种快速检测油脂或生物样品中的维生素D的方法，所述方法包括如下步骤：
[0020]S1：待测样品的制备；
[0021]S2：将待测样品使用多维谱系统进行维生素D的分离；
[0022]其中，所述多维谱系统包括依次连接的超临界谱部分及反相液相谱部分，所述反相液相谱部分中包括一个或一个以上的反相液相谱柱；
[0023]所述超临界谱部分包括超临界流动相以及改性剂，所述改性剂选自醇类物质、腈类物质或它们的水溶液，优选为甲醇或其水溶液；
[0024]S3：检测由S2步骤分离得到的维生素D。
[0025][2]根据[1]所述的方法，所述超临界谱部分包括一个超临界谱柱；所述反相液相谱部分中包括两个反相液相谱柱。
[0026][3].根据[1]或[2]所述的方法，所述多维谱系统中的谱柱通过多通阀组进行连接。
[0027][4].根据[1]-[3]中任一项所述的方法，所述超临界谱部分中：
[0028]固定相选自极性基团改性的硅胶，所述极性基团选自羟基、氨基或氰基，优选地，
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