(19)中华人民共和国国家知识产权局
(12)发明专利申请
(10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请号 202011571674.9
(22)申请日 2020.12.27
(71)申请人 青岛巴特菲科技发展有限公司
地址 266000 山东省青岛市高新区河东路
368号蓝生物医药产业园5号楼101
室
(72)发明人 李然栋 马清霞 薄慧文
(51)Int.Cl.
C12Q 1/70(2006.01)
C12Q 1/6851(2018.01)
(54)发明名称SARS-CoV-2全预混冻干荧光PCR检测试剂盒及其方法(57)摘要本发明公开了SARS ‑CoV ‑2全预混冻干荧光PCR检测试剂盒，包括冻干固态SARS ‑CoV ‑2RT ‑PCRMix，液态复溶Buffer、冻干固态阳性对照、冻干固态阴性对照，所述冻干固态SARS ‑CoV ‑2RT ‑PCRMix中含有SARS ‑CoV ‑2特异性基因ORF1ab、N 基因和人源内参基因RNAseP引物序列对应的引物组，本试剂盒基于荧光定量RT ‑PCR技术快速检测SARS ‑CoV ‑2，利用两对特殊引物和人源内参基因，特异性的体外扩增特异性序列，并结合荧光探针进行实时检测。该方法操作简便，对检测人员的操作水平要求低，可对大样本实现成本低廉的快速筛选。本试剂盒，全程检测仅需40分钟‑1小时， 结果准确可靠。权利要求书2页 说明书6页 附图1页CN 112725527 A 2021.04.30
C N 112725527
A
1.SARS‑CoV‑2全预混冻干荧光PCR检测试剂盒，其特征在于：包括冻干固态SARS‑CoV‑2RT‑PCR Mix，液态复溶Buffer、冻干固态阳性对照、冻干固态阴性对照，所述冻干固态SARS‑CoV‑2RT‑PCR Mix中含有SARS‑CoV‑2特异性基因ORF1ab、N基因和人源内参基因RNAse P引物序列对应的引物组。
2.根据权利要求1所述的SARS‑CoV‑2全预混冻干荧光PCR检测试剂盒，其特征在于：所述SARS‑CoV‑2特异性ORF1ab基因和N基因对应的引物组序列如下：
ORF1ab‑F：AAAGGTTATGGCTGTAGTTG
ORF1ab‑R：CGATTGTGCATCAGCTGACTG
ORF1ab‑P：TCAACTCCGCGAACCCATGCTT
N基因‑F：GTCAAGCCTCTTCTCGTTCC
N基因‑R：GGAGAAGTTCCCCTACTGC
N基因‑P：TTGAACTGTTGCGACTACGTGAT
所述人源内参基因RNAse P引物序列对应的引物组如下：
RNAse P‑F：AGATTTGGACCTGCGAGCG
RNAse P‑R：GAGCGGCTGTCTCCACAAGT
RNAse P‑P：TTCTGACCTGAAGGCTCTGCGCG。
3.根据权利要求1所述的SARS‑CoV‑2全预混冻干荧光PCR检测试剂盒，其特征在于：所述冻干固态SA
RS‑CoV‑2RT‑PCR Mix在冻干前含有0.1～0.8mmol/L dNTP、0.01～0.1U/μLTaq DNA聚合酶、1～10U/μLMMLV逆转录酶、0.1～2U/μL RNase抑制剂、0.01～0.06U/μLUDG 酶、0.2～0.9μmol/L ORF1ab、0.2～0.9μmol/LN基因、μmol/LRNase P的引物、探针以及3％～6％海藻糖、0.01％～0.1％甘氨酸、DTT、0.1％～1％牛血清白蛋白混合后制得冻干保护剂。
4.根据权利要求1所述的SARS‑CoV‑2全预混冻干荧光PCR检测试剂盒，其特征在于：所述复溶液含有3～10mmol/L MgSO4、7～13mmol/L KCl、13～22mmol/LTris‑HCl、8～15mmol/ L(NH4)2SO4、0.1～0.3％Triton X‑100以及0.3～1.6mol/L甜菜碱。
5.根据权利要求1所述的SARS‑CoV‑2全预混冻干荧光PCR检测试剂盒，其特征在于：所述阳性对照为体外合成的SARS‑CoV‑2特异性基因ORF1ab和N对应的冻干固态RNA，阴性对照为提纯的非SARS‑CoV‑2人工合成冻干固态RNA。
6.SARS‑CoV‑2全预混冻干荧光PCR检测试剂方法，其特征在于：它包括以下使用步骤：
(1)准备试剂：向每个带有冻干颗粒的PCR管中加15μL复溶Buffer RB，向阳性对照和阴性对照的冻干西林瓶中加50ul复溶Buffer RB；
(2)加入样品与对照：根据实验样品数量，在上述每个PCR管分别加入5ul提取后的样品RNA，并取上述复溶后的阴性、阳性对照5ul，加入到相应的PCR管中，扣上PCR管盖子；
(3)离心：将上述PCR管短暂离心后，放入荧光定量PCR仪内。
(4)PCR参数设置：仪器通道同时选择FAM、HEX和Cy5通道分别对应ORF1ab、N gene和内参RNAse P基因；
(5)进行PCR结果分析，验证试验是否成立并进行结果判定。
7.根据权利要求6所述的SARS‑CoV‑2全预混冻干荧光PCR检测试剂方法，其特征在于：所述步骤(4)中PCR参数设置后，PCR扩增程序为50℃15min，95℃3min，循环一次；95℃15s，
60℃60s，循环45次，在60℃收集荧光。
8.根据权利要求6所述的SARS‑CoV‑2全预混冻干荧光PCR检测试剂方法，其特征在于：所述步骤(5)中进行结果判定的具体步骤为当阴性对照在FAM、HEX通道均无扩张曲线，且阳性对照的在FAM、HEX通道的CT值<38时，试验成立。当样品的CT值≤40，且具有典型的S型扩增曲线，判为阳性；当样品的CT值>40，且无典型的S型曲线时，判为阴性。
SARS‑CoV‑2全预混冻干荧光PCR检测试剂盒及其方法
技术领域
[0001]本发明属于病毒快速检测试剂领域，具体涉及SARS‑CoV‑2全预混冻干荧光PCR检测试剂盒及其方法。
背景技术
[0002]2019冠状病毒病(Corona Virus Disease 2019，COVID‑19)是由新型冠状病毒(new Corona Virus，SARS‑CoV‑2)引起的急性呼吸道传染病。SARS‑CoV‑2属于β属的新型冠状病毒，为RNA病毒，其有包膜，颗粒呈圆形或椭圆形，常为多形性，直径60‑140nm，是目前已知的可以感染人的第7种冠状病毒，其余6种冠状病毒分别是HCoV‑229E、HCoV‑OC43、HCoV‑NL63、HCoV‑HKU1、SARS‑CoV和MERS‑CoV。其中前4种在人中较为常见，致病性较低，一般仅引起类似普通感冒的轻微呼吸道症状，另外2种是致病性较高的SARS冠状病毒和MERS冠状病毒。核酸检测是临床病原学诊断的常用方法，其具有灵敏高、特异性强等优点。目前，实时荧光RT‑PCR技术已被列入我国SARS‑CoV‑2诊疗指南，目前全国县级疾控中心全部要求开展荧光RT‑PCR检测。但是荧光RT‑PCR检测技术对实验室硬件和技术人员技术水平要求较高，全国疾控中心的PCR检测室的硬件和技术人员水平参差不齐，检测结果很难达到准确和一致。
[0003]因此，急需要研发出一种稳定性高、操作简易的检测试剂盒，减少试剂在运输和保存过程中反复冻融对PCR体系的影响，减少实验室人员操作不熟练对检测结果的影响，提高荧光RT‑PCR检测结果的稳定性、重复性和均一性。
发明内容
[0004]针对现有技术存在的不足，本发明在于提供一种SARS‑CoV‑2全预混冻干荧光PCR 检测试剂盒，包括冻干固态SARS‑CoV‑2RT‑PCR Mix，液态复溶Buffer、冻干固态阳性对照、冻干固态阴性对照，所述冻干固态SARS‑CoV‑2RT‑PCR Mix中含有SARS‑CoV‑2特异性基因ORF1ab、N基因和人源内参基因RNAse P引物序列对应的引物组。
[0005]进一步的，所述SARS‑CoV‑2特异性ORF1ab基因和N基因对应的引物组序列如下：[0006]ORF1ab‑F：AAAGGTTATGGCTGTAGTTG
[0007]ORF1ab‑R：CGATTGTGCATCAGCTGACTG
[0008]ORF1ab‑P：TCAACTCCGCGAACCCATGCTT
[0009]N基因‑F：GTCAAGCCTCTTCTCGTTCC
[0010]N基因‑R：GGAGAAGTTCCCCTACTGC
[0011]N基因‑P：TTGAACTGTTGCGACTACGTGAT
[0012]所述人源内参基因RNAse P引物序列对应的引物组如下：
[0013]RNAse P‑F：AGATTTGGACCTGCGAGCG
[0014]RNAse P‑R：GAGCGGCTGTCTCCACAAGT
[0015]RNAse P‑P：TTCTGACCTGAAGGCTCTGCGCG。
[0016]进一步的，所述冻干固态SARS‑CoV‑2RT‑PCR Mix在冻干前含有0.1～0.8mmol/L dNTP、0.01～0.1U/μL Taq DNA聚合酶、1～10U/μLMMLV逆转录酶、0.1～2U/μL RNase抑制剂、0.01～0.06U/μLUDG酶、0.2～0.9μmol/L ORF1ab、0.2～0.9μmol/L N基因、μmol/L RNase P的引物、探针以及3％～6％海藻糖、0.01％～0.1％甘氨酸、DTT、0.1％～1％牛血清白蛋白混合后制得冻干保护剂。
[0017]进一步的，所述复溶液含有3～10mmol/LMgSO4、7～13mmol/LKCl、13～22mmol/L Tris‑HCl、8～15mmol/L(NH4)2SO4、0.1～0.3％Triton X‑100以及0.3～1.6mol/L甜菜碱。[0018]进一步的，所述阳性对照为体外合成的SARS‑CoV‑2特异性基因ORF1ab和N对应的冻干固态RNA，阴性对照为提纯的非SARS‑CoV‑2人工合成冻干固态RNA。
[0019]本发明还提供了SARS‑CoV‑2全预混冻干荧光PCR检测试剂方法，它包括以下使用步骤：
[0020](1)准备试剂：向每个带有冻干颗粒的PCR管中加15μL复溶Buffer RB，向阳性对照和阴性对照的冻干西林瓶中加50ul复溶Buffer RB；
[0021](2)加入样品与对照：根据实验样品数量，在上述每个PCR管分别加入5ul提取后的样品RNA，并取上述复溶后的阴性、阳性对照5ul，加入到相应的PCR管中，扣上PCR管盖子；[0022](3)离心：将上述PCR管短暂离心后，放入荧光定量PCR仪内。
[0023](4)PCR参数设置：仪器通道同时选择FAM、HEX和Cy5通道分别对应ORF1ab、N gene 和内参RNAse P基因；
[0024](5)进行PCR结果分析，验证试验是否成立并进行结果判定。
[0025]进一步的，所述步骤(4)中PCR参数设置后，PCR扩增程序为50℃15min，95℃3min，循环一次；95℃15s，60℃60s，循环45次，在60℃收集荧光。
[0026]进一步的，所述步骤(5)中进行结果判定的具体步骤为当阴性对照在FAM、HEX通道均无扩张曲线，且阳性对照的在FAM、HEX通道的CT值<38时，试验成立。当样品的CT值≤40，且具有典型的S型扩增曲线，判为阳性；当样品的CT值>40，且无典型的S型曲线时，判为阴性。
[0027]与现有技术相比，本发明的有益效果是：本试剂盒基于荧光定量RT‑PCR技术快速检测SARS‑CoV‑2，利用2对特殊引物和人源内参基因，特异性的体外扩增特异性序列，并结合荧光探针进行实时检测。该方法操作简便，对检测人员的操作水平要求低，可对大样本实现成本低廉的快速筛选。本试剂盒，全程检测仅需45分钟‑1小时，结果准确可靠，具体表现如下：
[0028] 1.该荧光定量PCR检测试剂，结合冻干技术，在加入复合冻干保护剂，优化冻干工艺后，大大增加试剂稳定性，且便于常温运输，节约运输成本；
[0029] 2.该SARS‑CoV‑2RT‑PCRMix冻干试剂已经将RT‑PCR反应的引物、探针、反转录酶、PCR反应酶、PCR缓冲体系中的成分，全部按最优化的比例混匀，并分装到PCR管中，即溶即用，避免反复冻融和多次分装，使用简便快捷，更适于基层现场检测；
[0030] 3.同时检测人源内参基因，可以对临床样本的质量进行监控，提高检测结果的可信度。
[0031] 4.反应所需模板量少，灵敏度高，最低检验限可低至10copy/Test；
[0032] 5.反应体系中加入UDG酶，可有效减少气溶胶污染造成的假阳性结果；
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