(19)中华人民共和国国家知识产权局
(12)发明专利申请
(10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请号 202011229350.7
(22)申请日 2020.11.06
(71)申请人 郑州人福博赛生物技术有限责任公
司
地址 450000 河南省郑州市经济技术开发
区第一大街28号
申请人 宜昌人福药业有限责任公司
北京嘉德利康医疗科技有限公司
(72)发明人 纪方兴 常丽青 王珊 谢敏
(74)专利代理机构 郑州浩翔专利代理事务所
(特殊普通合伙) 41149
代理人 李伟
(51)Int.Cl.
G01N 33/50(2006.01)
G01N 15/14(2006.01)
(54)发明名称
(57)摘要
本发明公开了一种嗜碱性粒细胞脱颗粒检
控B、染试剂、溶解试剂和清洗缓冲液；所述刺
激缓冲液包括钙离子、肝素和白介素3；所述刺激
质控A为抗高亲和性IgE受体的单克隆抗体；所述
刺激质控B为fMLP；所述染试剂为anti ‑CD63‑
FITC和anti ‑CCR3‑PE的混合物。还公开了试剂盒
的应用和其检测方法。本发明的试剂盒可以用于
围术期过敏反应的检测，为改进围术期过敏反应
诊疗提供新的方法，使过敏反应得到及时诊断，
并对致敏原进行正确识别。权利要求书2页 说明书8页 附图7页CN 112415181 A 2021.02.26
C N 112415181
A
1.一种嗜碱性粒细胞脱颗粒检测试剂盒，其特征在于，包括刺激缓冲液、刺激质控A、刺激质控B、染试剂、溶解试剂和清洗缓冲液；所述刺激缓冲液包括钙离子、肝素和白介素3；所述刺激质控A为抗高亲和性IgE受体的单克隆抗体；所述刺激质控B为fMLP；所述染试剂为anti-CD63-FITC和anti-CCR3-PE的混合物。
2.根据权利要求1所述的嗜碱性粒细胞脱颗粒检测试剂盒，其特征在于，所述溶解试剂为NH4Cl、KHCO3或Na2EDTA的10倍浓缩液。
3.根据权利要求1所述的嗜碱性粒细胞脱颗粒检测试剂盒，其特征在于，所述刺激缓冲液、刺激质控A和刺激质控B均为冻干粉，所述染试剂为2.2mL，所述溶解试剂为25mL。
4.一种权利要求1所述的嗜碱性粒细胞脱颗粒检测试剂盒的应用，其特征在于，所述试剂盒用于速发型过敏反应的体外检测和引起超敏反应的可疑过敏原检测。
5.一种权利要求1所述的嗜碱性粒细胞脱颗粒检测试剂盒的检测方法，其特征在于，包括以下步骤：
（1）样本的采集：将静脉采血管颠倒数次，混匀抗凝血样；
（2）标记试管：对于每个患者，分别在每个试管上进行标记，
其中：PB = 患者背景；
PC1 = 抗高亲和性IgE受体的单克隆抗体刺激质控；
PC2 = fMLP刺激质控；
Ax-y=过敏原；
（3）细胞刺激：在每个患者标记好的试管中分别加入试剂盒中的刺激物；
PB试管中加入50μL刺激缓冲液，作为检测背景，
PC1试管中加入50μL刺激质控A，
PC2试管中加入50μL 的刺激质控B，
Ax-y试管中加入50μL过敏原溶液；
然后，在上述每个试管中分别加入100μL刺激缓冲液和50μL患者全血样本，轻柔混合；
（4）染：向上述试管中分别加入20μL的染试剂，轻柔混合，盖上管盖，37℃下水浴孵育15分钟；
（5）溶解：在步骤（4）的每个试管中分别加入2mL溶解试剂，轻柔混合；然后在离心机内离心5分钟，去除上清液，并用吸水纸进行吸干处理，之后用清洗缓冲液重悬细胞，轻柔涡旋，得到细胞混悬液；
（6）检测：对步骤（5）所得的细胞混悬液采用流式细胞仪进行检测。
6.根据权利要求5所述的嗜碱性粒细胞脱颗粒检测试剂盒的检测方法，其特征在于，步骤（1）中血样的保存：对于蛋白质过敏原的检测，血样采集后需要立即进行细胞刺激或者在2-8℃下最多保存48小时；对于药物和化学过敏原的检查，采集后的血样在2-8℃下最多保存24小时。
7.根据权利要求5所述的嗜碱性粒细胞脱颗粒检测试剂盒的检测方法，其特征在于，步骤（5）中的溶解试剂需要预热至18-28℃。
8.根据权利要求5所述的嗜碱性粒细胞脱颗粒检测试剂盒的检测方法，其特征在于，步骤（5）中离心机的离心力为500xg。
9.根据权利要求5所述的嗜碱性粒细胞脱颗粒检测试剂盒的检测方法，其特征在于，步
骤（5）中清洗缓冲液为300μL。
10.根据权利要求5所述的嗜碱性粒细胞脱颗粒检测试剂盒的检测方法，其特征在于，步骤（6）中的细胞混悬液需要在避光2-8℃下进行保存。
一种嗜碱性粒细胞脱颗粒检测试剂盒、检测方法及其应用
技术领域
[0001]本发明涉及过敏反应检测技术领域，具体涉及一种嗜碱性粒细胞脱颗粒检测试剂盒、检测方法及其应用。
背景技术
[0002]近年来，随着麻醉过程中大量合成药物的广泛应用，临床中发现麻醉药物诱发的严重过敏反应(Anaphylaxis)也在逐年增高。资料显示，围术期过敏反应发生率介于1/ 20000～1/3500，更有报道认为发生率可达1/353，因此并非罕见。绝大多数患者的围术期致敏原无法明确，他们再次接受手术时依然要面临再次过敏的风险。目前，尚无麻醉过程中药物诱发严重过敏反应的标准化诊断体系，且国内外缺乏对其高危因素的系统研究。很多麻醉科医生对于围术期过敏反应的认识不足，从而出现诊疗不及时或错误。同时，由于致敏原的检测手段有限，绝大部分仅能凭借病史进行初步的判断。无论医生还是患者，对于改进围术期过敏反应诊疗的意愿都很迫切。
[0003]寻检测围术期严重过敏反应致敏原的有效方法，对于指导患者再次手术用药，降低围术期风险意义重大。致敏原的检测方法分为体内法和体外法。体内法包括皮肤试验(Skin Test,ST)和激发试验等，体外试验包括组胺(Histamine)和类胰蛋白酶(Tryptase)水平检测、sIgE检测等。然而，目前尚无统一明确的围术期致敏原检测方法。
[0004]由于存在诱发严重过敏反应的风险，临床中无法采用激发试验(Provocation Test,PT)这一金标准来确诊围术期致敏原，而ST是临床中致敏原检测最常用的手段，主要包括皮肤点刺试验法(SPT)和皮内试验法(IDT)。由于ST可通过非IgE途径直接刺激皮肤肥大细胞产生组胺而出现假阳性结果，因此目前对其检测致敏原的有效性有一定争议。另外，ST对操作和试验药物浓度要求较为严格，且存在一定的疼痛刺激及诱发全身过敏反应的风险，这些都限制了皮肤试验在围术期致敏原检测中的应用。
[0005]体外检测手段避免了患者暴露的风险的同时减少了其他的干扰因素，是皮肤试验有效的补充。sIgE检测是公认可靠的过敏性疾病体外检测方法，常用的检测手段有放射性变应原吸附试验(Radioallergosorbent Test，RAST)和ImmunoCAP系统等。ImmunoCAP系统是目前最先进的sIgE定量检测系统，它是在RAST基础上发展起来的荧光酶免疫检测法(RAST FEIA)，其检测原理是抗原或致敏原在固定相上与特定的人类抗体IgE结合，样品中的抗原与固定相上的抗原竞争性结合IgE，再将酶标抗IgE二抗加入到固有相中，最后测定荧光并与标准曲线比较。ImmunoCAP对sIgE的检测准确可靠，结果与临床相关性好。ImmunoCAP常用于食物和吸入性变应原的检测，具有较高的诊断敏感度和特异度，
但其检测围术期过敏反应致敏原的相关资料很少，国内尚未开展相关研究。
发明内容
[0006]有鉴于此，本发明的目的是针对现有技术的不足，提供一种嗜碱性粒细胞脱颗粒检测试剂盒、检测方法及其应用，该试剂盒可以用于围术期过敏反应的检测，为改进围术期
过敏反应诊疗提供新的方法，使过敏反应得到及时诊断，并对致敏原进行正确识别。[0007]为达到上述目的，本发明采用以下技术方案：
[0008]一种嗜碱性粒细胞脱颗粒检测试剂盒，包括刺激缓冲液、刺激质控A、刺激质控B、染试剂、溶解试剂和清洗缓冲液；所述刺激缓冲液包括钙离子、肝素和白介素3；所述刺激质控A为抗高亲和性IgE受体的单克隆抗体；所述刺激质控B为fMLP；所述染试剂为anti-CD63-FITC和anti-CCR3-PE的混合物。
[0009]优选的，所述溶解试剂为NH4Cl、KHCO3或Na2EDTA的10倍浓缩液。
[0010]优选的，所述刺激缓冲液、刺激质控A和刺激质控B均为冻干粉，所述染试剂为2.2mL，所述溶解试剂为25mL。刺激缓冲液用50mL除热源水复溶，刺激质控A和刺激质控B用1.5mL除热源水复溶。
[0011]一种嗜碱性粒细胞脱颗粒检测试剂盒的应用，所述试剂盒用于速发型过敏反应的体外检测和引起超敏反应的可疑过敏原检测。
[0012]一种嗜碱性粒细胞脱颗粒检测试剂盒的检测方法，包括以下步骤：
[0013](1)样本的采集：将静脉采血管颠倒数次，混匀抗凝血样；
[0014](2)标记试管：对于每个患者，分别在每个试管上进行标记，
[0015]其中：PB＝患者背景；
[0016]PC1＝抗高亲和性IgE受体的单克隆抗体刺激质控；
[0017]PC2＝fMLP刺激质控；
[0018]Ax-y＝过敏原；
[0019](3)细胞刺激：在每个患者标记好的试管中分别加入试剂盒中的刺激物；[0020]PB试管中加入50μL刺激缓冲液，作为检测背景，
[0021]PC1试管中加入50μL刺激质控A，
[0022]PC2试管中加入50μL的刺激质控B，
[0023]Ax-y试管中加入50μL过敏原溶液；
[0024]然后，在上述每个试管中分别加入100μL刺激缓冲液和50μL患者全血样本，轻柔混合；
[0025](4)染：向上述试管中分别加入20μL的染试剂，轻柔混合，盖上管盖，37℃下水浴孵育15分钟；
[0026](5)溶解：在步骤(4)的每个试管中分别加入2mL溶解试剂，轻柔混合；然后在离心机内离心5分钟，去除上清液，并用吸水纸进行吸干处理，之后用清洗缓冲液重悬细胞，并置于涡旋混匀器内轻柔涡旋，得到细胞混悬液；
[0027](6)检测：对步骤(5)所得的细胞混悬液采用流式细胞仪进行检测。
[0028]优选的，步骤(1)中血样的保存：对于蛋白质过敏原的检测，血样采集后需要立即进行细胞刺激或者在2-8℃下最多保存48小时；对于药物和化学过敏原的检查，采集后的血样在2-8℃下最多保存24小时。
[0029]优选的，步骤(5)中的溶解试剂需要预热至18-28℃。溶解试剂在2-8℃
[0030]保存时可能形成结晶，稀释前于18-28℃放置使结晶溶解。
[0031]优选的，步骤(5)中离心机的离心力为500xg。
[0032]优选的，步骤(5)中清洗缓冲液为300μL。
豫公网安备41160202000603
站长QQ:729038198
关于我们
投诉建议