(19)国家知识产权局
(12)发明专利申请
(10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请号 202210121010.5
(22)申请日 2022.02.09
(71)申请人 浙江康佰裕生物科技有限公司
地址 310051 浙江省杭州市滨江区滨安路
688号天和高科产业园
(72)发明人 朱建高 杨文君 牛敏杰
(74)专利代理机构 北京纪凯知识产权代理有限
公司 11245
专利代理师 关畅
(51)Int.Cl.
G01N 33/68(2006.01)
G01N 33/577(2006.01)
C07K 14/47(2006.01)
C07K 1/34(2006.01)
C07K 16/18(2006.01)
C07K 16/06(2006.01)
(54)发明名称
残留检测方法的建立及其应用
(57)摘要
本发明属于生物制品检测领域，
具体涉及针对逆转录病毒稳产细胞PG13的宿主蛋白残留检
测方法的建立及其应用。本发明提供了检测PG13
稳产株所产的逆转录病毒或/和由所述逆转录病
毒制备的CAR ‑T细胞中残留宿主蛋白的试剂盒，
所述试剂盒包括抗PG13‑HCP抗体、标记物偶联抗
体和抗原标准品，所述抗PG13‑HCP抗体是以
PG13‑HCP抗原为免疫原得到的多克隆抗体或单
克隆抗体，所述标记物偶联抗体是用标记物偶联
所述抗PG13‑HCP抗体得到的化合物，所述抗原标
准品为所述PG13‑HCP抗原。结果显示抗PG13‑HCP
特异性多克隆抗体可较全面地覆盖PG13‑HCP抗
原蛋白，并且不会与人来源的逆转录病毒蛋白成
分产生交叉反应，灵敏度可达15.6ng/mL，因此该
方法实现了高灵敏度和特异性的PG13‑HCP残留
检测，使逆转录病毒生产符合GMP和临床应用的
要求。权利要求书2页 说明书12页 附图3页CN 114441774 A 2022.05.06
C N 114441774
A
1.检测PG13来源的残留宿主蛋白的试剂盒，其特征在于：所述试剂盒包括抗PG13‑HCP 抗体、标记物偶联抗体和抗原标准品，所述抗PG13‑HCP抗体是以PG13‑HCP抗原为免疫原得到的多克隆抗体或单克隆抗体，所述标记物偶联抗体是用标记物偶联所述抗PG13‑HCP抗体得到的化合物，所述抗原标准品为所述PG13‑HCP抗原；所述PG13‑HCP抗原为按照下述步骤的方法制备获得：
(1)细胞培养：培养所述包装细胞系，收集PG13细胞培养上清液； (2)PG13细胞培养上清液的纯化：使用膜分离孔径为0.45μm、纤维内径为1mm的中空纤维柱对所述PG13‑HCP细胞培养上清液进行微滤纯化，调节流速为210mL·min‑1，使剪切速率为6000s‑1，收集滤出液；
(3)超滤浓缩：步骤(2)获得的滤出液用截留分子量为3kD的超滤管进行浓缩，获得PG13‑HCP抗原浓缩液；提取PG13‑HCP抗原浓缩液的总蛋白得到粗提的PG13‑HCP抗原；
(4)透析：将步骤(3)获得的粗提的PG13‑HCP抗原进行截留分子量为3500Da的透析，得到PG13‑HCP抗原。
2.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于：所述(1)中细胞培养的培养基分为DMEM 完全培养基和DMEM无血清培养基，所述DMEM完全培养基由DMEM基础培养基、胎牛血清、谷氨酰胺、青霉素和链霉素组成，所述DMEM完全培养基中，胎牛血清的体积百分含量为10％，青霉素的含量为100IU/mL，链霉素的含量为100μg/mL，谷氨酰胺的含量为1mmoL/L，以上成分用DMEM基础培养基溶解定量；所述DMEM无血清培养基中，胎牛血清的体积百分含量为0％，青霉素的含量为100IU/mL，链霉素的含量为100μg/mL，谷氨酰胺的含量为1mmoL/L，以上成分用DMEM基础培养基溶解定量。
3.根据权利要求1或2所述的试剂盒，其特征在于：所述(1)细胞培养中，收集细胞培养上清液之前还包括换液的步骤，所述换液为细胞培养24h后吸弃上清液，加入PBS润洗弃上清液，再用DMEM培养基润洗弃上清液，加DMEM无血清培养基，继续培养4d。
4.根据权利要求1‑3中任一项所述的试剂盒，其特征在于：所述(1)细胞培养中，所述收集上清液为收集细胞铺板后第2天到第5天上清液。
5.根据权利要求1‑4中任一项所述的试剂盒，其特征在于：所述(2)PG13细胞培养上清液的纯化在2‑8℃进行。
6.根据权利要求1‑5中任一项所述的试剂盒，其特征在于：所述抗PG13‑HCP抗体为兔源多克隆抗体。
7.权利要求1‑6中任一项所述的试剂盒在检测PG13稳产株所产的逆转录病毒或/和由所述逆转录病毒制备的CAR‑T细胞的残留宿主蛋白中的应用，其特征在于：所述PG13稳产株是将包含目的DNA分子的逆转录病毒载体导入PG13稳定包装细胞系得到的转基因细胞系；
所述CAR‑T细胞是将所述PG13稳产株所产的逆转录病毒感染T细胞获得的CAR‑T。
8.检测PG13稳产株所产的逆转录病毒或/和由所述逆转录病毒制备的CAR‑T细胞的残留宿主蛋白的方法，其特征在于：所述方法包括使用权利要求1‑6中任一项所述的试剂盒检测PG13稳产株所产的逆转录病毒或/和由所述逆转录病毒制备的CAR‑T细胞的残留宿主蛋白；
所述PG13稳产株是将包含目的DNA分子的逆转录病毒载体导入PG13稳定包装细胞系得
到的转基因细胞系；
所述CAR‑T细胞是将所述PG13稳产株所产的逆转录病毒感染T细胞获得的CAR‑T。
9.PG13‑HCP抗原的制备方法，其特征在于：所述制备方法包括下述步骤：
(1)细胞培养：培养所述包装细胞系，收集PG13细胞培养上清液；
(2)PG13细胞培养上清液的纯化：使用膜分离孔径为0.45μm、纤维内径为1mm的中空纤维柱对所述PG13‑HCP上清液进行微滤纯化，调节流速为210mL·min‑1，使剪切速率为6000s ‑1，收集滤出液；
(3)超滤浓缩：步骤(2)获得的滤出液用截留分子量为3kD的超滤管进行浓缩，获得PG13‑HCP抗原浓缩液；提取PG13‑HCP抗原浓缩液的总蛋白得到粗提的PG13‑HCP抗原；
(4)透析：将步骤(3)获得的粗提的PG13‑HCP抗原进行截留分子量为3500Da的透析，得到PG13‑HCP抗原。
10.PG13‑HCP抗原在检测PG13稳产株所产的逆转录病毒或/和由所述逆转录病毒制备的CAR‑T细胞的残留宿主蛋白中的应用，其特征在于：
所述PG13稳产株是将包含目的DNA分子的逆转录病毒载体导入PG13稳定包装细胞系得到的转基因细胞系；
所述CAR‑T细胞是将所述PG13稳产株所产的逆转录病毒感染T细胞获得的CAR‑T。
针对逆转录病毒稳产细胞PG13的宿主蛋白残留检测方法的建
立及其应用
技术领域
[0001]本发明属于生物制品检测领域，具体涉及针对逆转录病毒稳产细胞PG13的宿主蛋白残留检测方法的建立及其应用。
背景技术
[0002]残留宿主蛋白(Host Cell Proteins)，HCP是来自生产细胞系的宿主细胞的蛋白成分，包括宿主细胞结构蛋白和分泌蛋白。残留HCP是生物制品生产过程中的杂质。在生物制品生产过程中，宿主细胞会分泌数十种蛋白因子、且部分宿主细胞死亡，释放蛋白内容物等，均属于HCP残留。有研究表明，HCP会刺激人体免疫系统，引起过敏反应或其他不良反应。此外，HCP还可能引发机体对蛋白药物产生抗体，影响药物的效果。
[0003]然而，生物制品中HCP种类十分复杂，如CHO细胞蛋白不少于477种，甚至可能超过1000种，且有关的表达产物存在独特的翻译后修饰，增加了HCP的复杂性。以现有技术水平，尚无法完全确定某一生物制品中残留HCP的全部组分。另一方面，生物制品的生产工艺具有独特性，对于不同物种来源，不同基因修饰的宿主细胞，产生的HCP组分可能完全不同。因此难以制定针对某一特定工艺的HCP检测方案。目前，商业化的HCP检测方案大多针对特定细胞的HCP抗原制备独特的多克隆抗体，通过ELISA的方法检测生物制品中的HCP残留，例如CHO HCP ELISA检测试剂盒、Vero HCP ELISA检测试剂盒和大
肠埃希菌残留菌体蛋白检测试剂盒等。然而，诸多因素，例如不同基因背景，基因修饰手段，以及不同工艺处理方式，可能改变细胞系的基因表达谱和HCP组分。通用型商业化试剂盒无法针对特定工艺和细胞系检出特异HCP，易带来漏检的风险，从而增加了生物制品安全风险。
[0004]γ‑逆转录病毒(以下简称逆转录病毒)是基因常用的载体形式之一。与慢病毒不同，逆转录病毒的生产过程仅使用稳定产生逆转录病毒颗粒的稳产细胞系，通过收集稳产细胞培养上清液，并经过适当的纯化步骤，获得具有临床应用潜力的逆转录病毒液。稳产细胞系的制作方法一般为：将包含整合LTR顺式元件的目的基因的逆转录病毒载体瞬时转染导入稳定包装细胞系，或者采用瞬时‑稳定包装“乒乓感染法”用另一包装细胞系产生的病毒感染稳定包装细胞系，多次筛选后获得具有高产毒滴度的稳产细胞系。稳定包装细胞系可以提供逆转录病毒包装所需的gag，pol，env基因，而缺乏基因整合所需的LTR顺式元件。因gag，pol，env基因分别整合在基因组中不同位点，稳定包装细胞系在外源导入包含LTR的目的基因后，可产生一次感染能力且不具有复制能力的逆转录病毒，成为稳产细胞系。常见的稳定包装细胞系包括PA317，PG13和AM12等，他们是基于不同的起始细胞系，不同表达载体和病毒包膜种类获得的，具有不同种属亲嗜性。例如PG13是由小鼠成纤维细胞NIH3T3改造，整合莫洛尼氏白血病毒(MLV)表达载体和长臂猿白血病病毒(GALV)包膜蛋白基因获得，因其特定的包膜结构，其生产的逆转录病毒对人类T细胞等淋巴细胞具有亲嗜性。PG13细胞生产的逆转录病毒，已表现出在SCID‑X1(X‑linked severe combined，immunodeficiency)，ADA‑SCID(adenosine deaminase deficient SCID)和CGD(chronic
granulomatous disease)等疾病基因和CAR‑T细胞领域的应用潜力。在逆转录病毒的生产过程中，因细胞破裂释放的结构蛋白和除病毒颗粒以外的分泌蛋白均可能成为HCP残留，对逆转录病毒的终产品造成污染，因此，GMP生产要求对逆转录病毒液及下游终产品的HCP残留进行检测和管控。然而，因逆转录病毒生产工艺的特殊性，迄今为止仍没有基于逆转录病毒稳产细胞系的HCP检测方法。
发明内容
[0005]本发明要解决的技术问题是：如何检测PG13稳产株所产的逆转录病毒或/和由所述逆转录病毒制备的CAR‑T细胞中的残留宿主蛋白(HCP)。
[0006]为解决上述技术问题，第一个方面，本发明提供了检测PG13(包装细胞系)来源的残留宿主蛋白的试剂盒，所述试剂盒包括抗PG13‑HCP抗体、标记物偶联抗体和抗原标准品，所述抗PG13‑HCP抗体是以PG13‑HCP抗原为免疫原得到的多克隆抗体或单克隆抗体，所述标记物偶联抗体是用标记物偶联所述抗PG13‑HCP抗体得到的化合物，所述抗原标准品为所述PG13‑HCP抗原；所述PG13‑HCP抗原可按照下述步骤的方法制备获得：
[0007](1)细胞培养：培养所述包装细胞系，收集细胞培养上清液，将该上清液命名为PG13‑HCP上清液；
[0008](2)PG13‑HCP上清液的纯化：使用膜分离孔径为0.45μm、纤维内径为1mm的中空纤维柱对所述PG13‑HCP上清液进行微滤纯化，调节流速为210mL·min‑1，使剪切速率为6000s ‑1，收集滤出液；
[0009](3)超滤浓缩：步骤(2)获得的滤出液用截留分子量为3kD的超滤管进行浓缩，获得PG13‑HCP蛋白浓缩液；提取PG13‑HCP蛋白浓缩液的总蛋白得到粗提的PG13‑HCP抗原；[0010](4)透析：将步骤(3)获得的粗提的PG13‑HCP抗原进行截留分子量为3500Da的透析，得到PG13‑HCP抗原。
[0011]本发明中，PG13来源的残留宿主蛋白可为PG13稳产株所产的逆转录病毒中残留的宿主蛋白或/和由所述逆转录病毒制备的CAR‑T细胞中残留的宿主蛋白；
[0012]所述PG13稳产株是将包含目的DNA分子的逆转录病毒载体导入PG13稳定包装细胞系得到的转基因细胞系；所述CAR‑T细胞是将所述PG13稳产株所产的逆转录病毒感染T细胞获得的CAR‑T。
[0013]上述试剂盒中，所述CAR‑T细胞可由健康人或病人外周血单个核细胞(PBMC)，分离纯化T细胞，经过激活，基因转导和细胞培养等过程制备获得。以上CAR‑T细胞制备过程，除基因转导过程为用包含目的DNA分子的逆转录病毒感染T细胞外，其余技术均为常规技术。[0014]上述试剂盒中，所述抗PG13‑HCP抗体可为兔源、鼠源、马源、羊源、猪源、兔源或豚鼠源抗体。
[0015]在本发明的一个具体实施例中，所述抗PG13‑HCP抗体为兔源。
[0016]上述试剂盒还可包括进行酶联免疫检测所需的包被缓冲液、洗涤液、封闭液、二抗稀释液。
[0017]上述试剂盒中，所述抗PG13‑HCP抗体可固定于固相载体中。
[0018]上述试剂盒中，可作为所述固相载体的物质很多，如聚苯乙烯、纤维素、聚丙烯酰胺、聚乙烯、聚丙烯、交联葡聚糖、玻璃、硅橡胶、琼脂糖凝胶等。该固相载体的形式可以是试
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