(19)中华人民共和国国家知识产权局
(12)发明专利申请
(10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请号 202011603814.6(22)申请日 2020.12.29
(71)申请人 植恩生物技术股份有限公司
地址 401329 重庆市九龙坡区高新大道28
号金凤生物医药产业园标准厂房1-6号
申请人 重庆柳江医药科技有限公司(72)发明人 卢念红 李玉芳 夏家荣 徐荣秀
谭瑶 傅启昌 牟祥 (51)Int.Cl.
G01N 30/06(2006.01)G01N 30/74(2006.01)
(54)发明名称
一种枸橼酸西地那非中有关物质N-甲基哌嗪的检测方法 (57)摘要
本发明公开了一种枸橼酸西地那非中有关物质N ‑甲基哌嗪的检测方法，所述的检测方法为衍生‑高效液相谱法。所述的衍生方法为加入适量苯甲酰氯衍生试剂，经衍生化反应后，再用稀释剂稀释至所需浓度，得衍生待测溶液；所述高效液相谱法采用十八烷基硅烷键合硅胶为固定相的谱柱、以缓冲盐溶液和乙腈为流动相对衍生反应待测液进行分离检测的衍生‑高效液相谱法。所述衍生‑高效液相谱法有效解决了N ‑甲基哌嗪杂质在GC检测法中拖尾严重、灵敏度低且响应不成线性的问题。所述衍生‑高效液相谱法实用性强，检测过程简单、快捷、灵敏度 好。
权利要求书2页 说明书8页 附图2页
CN 112798719 A 2021.05.14
C N 112798719
A
1.一种枸橼酸西地那非中有关物质N‑甲基哌嗪的检测方法，其特征在于该检测方法采用柱前衍生‑高效液相谱法；包括如下步骤：
柱前衍生法：柱前衍生采用衍生试剂与枸橼酸西地那非中有关物质N‑甲基哌嗪反应形成带共轭基团的衍生产物；
高效液相谱法：采用十八烷基硅烷键合硅胶为固定相的谱柱、以缓冲盐水溶液为流动相A和乙腈为流动相B进行分离检测。
2.根据权利要求1所述的检测方法，其中，所述衍生试剂选自苯甲酰氯、4‑氟苯甲酰氯、和4‑甲基苯磺酰氯中的一种。
3.根据权利要求2所述的检测方法，其中，所述衍生试剂苯甲酰氯。
4.根据权利要求1所述的检测方法，其中，所述缓冲盐水溶液为以体积比计0.1%磷酸水溶液，三乙胺调pH至7.0；或20mM磷酸二氢钾水溶液，120g/L氢氧化钾溶液调pH至6.5。
5.根据权利要求4所述的检测方法，其中，所述缓冲盐水溶液为20mM磷酸二氢钾水溶液，120g/L氢氧化钾溶液调pH至
6.5。
6.根据权利要求1所述的检测方法，其中，所述谱柱为Z O R B A X X D B‑C18、InertSustain C18、ZORBAX SB‑C18、或ZORBAX Eclipse Plus C18。
7.根据权利要求1至6中任一项所述的检测方法，其中，采用梯度进行洗脱的，所述流动相A与流动相B体积比列为如下梯度：
时间（min）01416232530
流动相A（%）80‑9080‑9030‑4030‑4080‑9080‑90
流动相B（%）20‑1020‑1070‑6070‑6020‑1020‑10
优选如下梯度：
。
8.根据权利要求7所述的检测方法，包括如下步骤：
（1）配制缓冲盐水溶液：20mM磷酸二氢钾溶液，用120g/L氢氧化钾溶液调pH至6.5；
（2）配制流动相A：取缓冲盐水溶液作为流动相A；
（3）配制流动相B：取乙腈
（4）配制0.5µl/ml的苯甲酰氯溶液：取适量苯甲酰氯溶解于乙腈中；
（5）配制0.5µl/ml三乙胺溶液：取适量三乙胺溶解于乙腈中；
（6）配制稀释剂：取流动相A与流动相B，以体积比为流动相A：流动相B=90：10混匀而得；
（7）配制N‑甲基哌嗪对照品衍生溶液：取适量N‑甲基哌嗪溶解于乙腈中，配成50µg/ml 的N‑甲基哌嗪贮备液；再取1ml 50µg/ml的N‑甲基哌嗪贮备液于50ml量瓶中，加入1ml 0.5µl/ml苯甲酰氯溶液，摇匀，反应1分钟，加入1ml 0.5µl/ml三乙胺溶液，摇匀，用稀释剂稀释至刻度，摇匀，即得；
（8）配制枸橼酸西地那非供试品衍生溶液：称取50mg 枸橼酸西地那非供试品于50ml量瓶中，加入1ml乙腈，加入1ml 0.5µl/ml苯甲酰氯溶液，摇匀，反应1分钟，加入1ml 0.5µl/ml 三乙胺溶液，摇匀，用稀释剂稀释至刻度，摇匀即得；
（9）测定：取N‑甲基哌嗪对照品衍生溶液、枸橼酸西地那非供试品衍生溶液采用高效液相谱方法进行分离检测；
（10）高效液相谱方法：
谱柱：ZORBAX Eclipse Plus C18
检测波长：230nm；
柱温：35℃；
梯度洗脱：
。
一种枸橼酸西地那非中有关物质N‑甲基哌嗪的检测方法
技术领域
[0001]本发明属于药物分析化学领域，涉及枸橼酸西地那非有关物质N‑甲基哌嗪的检测方法，具体涉及采用衍生‑高效液相谱法分离测定枸橼酸西地那非有关物质N‑甲基哌嗪含量的检测方法。
背景技术
[0002]N‑甲基哌嗪是合成枸橼酸西地那非的重要物料，枸橼酸西地那非可能会发生降解反应产生N‑甲基哌嗪，因此枸橼酸西地那非中可能含有有关物质N‑甲基哌嗪，需要对其进行研究控制。目前报道的检测N‑甲基哌嗪含量的方法主要有高氯酸滴定法、气相谱法、质谱法。
[0003]高氯酸滴定法仅适用于高浓度N‑甲基哌嗪含量的测定，且枸橼酸西地那非也会与高氯酸发生反应，因此限度0.1％水平的N‑甲基哌嗪的含量无法用高氯酸滴定法准确测定。[0004]文献报道可以用气相谱法检测N‑甲基哌嗪的含量，但在进行用气相谱法检测枸橼酸西地那非有关物质N‑甲基哌嗪含量的方法开发时发现，不同谱柱条件下，拖尾较严重，可能因为N‑甲基哌嗪为弱碱性化合物且含有N‑H键所致，从而导致1ug/ml、10ug/ml、100ug/ml的N‑甲基哌嗪的响应不成线性，进而导致灵敏度较低，所用供试品枸橼酸西地那非浓度较高等问题。
[0005]质谱法仪器设备较昂贵，检测费用较高，不适宜工厂QC检测。
发明内容
[0006]本发明提供了一种衍生‑高效液相谱法进行枸橼酸西地那非中有关物质N‑甲基哌嗪含量的检测方法；该检测方法的检测灵敏度高、线性好、所需供试品浓度较小、分析时间短等，有效解决了现有技术中存在的灵敏度低、低浓度时响应不成线性导致检测结果不准确的问题。可以对N‑甲基哌嗪进行有效控制，保证了枸橼酸西地那非的质量。
[0007]在本发明的实施方案中，本发明提供了一种枸橼酸西地那非中有关物质N‑甲基哌嗪含量的检测方法，所述的检测方法采用柱前衍生‑高效液相谱法：
[0008]柱前衍生采用衍生试剂与枸橼酸西地那非中有关物质N‑甲基哌嗪反应形成带共轭基团的衍生产物；
[0009]在本发明的实施方案中，本发明所述的检测方法，其中，衍生试剂为苯甲酰氯、4‑氟苯甲酰氯或4‑甲基苯磺酰氯，优选苯甲酰氯。
[0010]在本发明的实施方案中，本发明所述的检测方法，其中，衍生试剂与N‑甲基哌嗪的衍生反应如下式：
[0011]
[0012]在本发明的实施方案中，本发明所述的检测方法，其中，所述高效液相谱法采用
十八烷基硅烷键合硅胶为固定相的谱柱、以缓冲盐水溶液为流动相A和乙腈为流动相B。[0013]在本发明的实施方案中，本发明所述的检测方法，其中，所述缓冲盐水溶液选自以体积比计0.1％磷酸水溶液，三乙胺调pH至7.0；或20mM磷酸二氢钾水溶液，120g/L氢氧化钾溶液调pH至6.5，优选地，为20mM磷酸二氢钾水溶液，120g/L氢氧化钾溶液调pH至6.5。[0014]在本发明的实施方案中，本发明所述的检测方法，其中，所述高效液相谱方法的谱柱选自十八烷基硅烷键合硅胶为固定相的谱柱，优选Z O R B A X X D B‑C18、InertSustain C18、ZORBAX SB‑C18、或ZORBAX Eclipse Plus C18；
[0015]在本发明的实施方案中，本发明所述的检测方法，其中，采用梯度进行洗脱的，所述流动相A与流动相B体积比列为如下梯度：
[0016]时间(min)01416232530流动相A(％)80‑9080‑9030‑4030‑4080‑9080‑90
流动相B(％)20‑1020‑1070‑6070‑6020‑1020‑10 [0017]优选如下梯度：
[0018]时间(min)01416232530缓冲盐水溶液(％)858535358585
乙腈(％)151565651515 [0019]在本发明的实施方案中，本发明所述的检测方法，其中，详细步骤如下：
[0020](1)配制缓冲盐水溶液：20mM磷酸二氢钾溶液，用120g/L氢氧化钾溶液调pH至6.5；[0021](2)配制流动相A：取缓冲盐水溶液作为流动相A；
[0022](3)配制流动相B：取乙腈
[0023](4)配制0.5μl/ml的苯甲酰氯溶液：取适量苯甲酰氯溶解于乙腈中；
[0024](5)配制0.5μl/ml三乙胺溶液：取适量三乙胺溶解于乙腈中；
[0025](6)配制稀释剂：取流动相A与流动相B，以体积比为流动相A：流动相B＝90：10混匀而得；
[0026](7)配制N‑甲基哌嗪对照品衍生溶液：取适量N‑甲基哌嗪溶解于乙腈中，配成50μg/ml的N‑甲基哌嗪贮备液；再取1ml 50μg/ml的N‑甲基哌嗪贮备液于50ml量瓶中，加入1ml 0.5μl/ml苯甲酰氯溶液，摇匀，反应1分钟，加入1ml 0.5μl/ml三乙胺溶液，摇匀，用稀释剂稀释至刻度，摇匀，即得；
[0027](8)配制枸橼酸西地那非供试品衍生溶液：称取50mg枸橼酸西地那非供试品于50ml量瓶中，加入1ml乙腈，加入1ml 0.5μl/ml苯甲酰氯溶液，摇匀，反应1分钟，加入1ml 0.5μl/ml三乙胺溶液，摇匀，用稀释剂稀释至刻度，摇匀即得；
[0028](9)测定：取N‑甲基哌嗪对照品衍生溶液、枸橼酸西地那非供试品衍生溶液采用高效液相谱方法进行分离检测；
[0029](10)高效液相谱方法：
[0030]谱柱：ZORBAX Eclipse Plus C18
[0031]检测波长：230nm；
[0032]柱温：35℃；
[0033]梯度洗脱：
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