(19)中华人民共和国国家知识产权局
(12)发明专利申请
(10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请号 201810914869.5
(22)申请日 2018.08.13
(71)申请人 北京弘润天源基因生物技术有限公
司
地址 100085 北京市海淀区上地开拓路5号
2层B222室
(72)发明人 王培培 沈丽 邓钺 黄庆雷
(74)专利代理机构 北京纪凯知识产权代理有限
公司 11245
代理人 关畅 任凤华
(51)Int.Cl.
G01N 33/68(2006.01)
G01N 33/543(2006.01)
G01N 33/531(2006.01)
G01N 21/78(2006.01)
(54)发明名称
备方法与应用
(57)摘要
本发明公开了细胞上清的总蛋白定量检测
包被的酶标板和考马斯亮蓝G250染液，所述标
准品包被的酶标板按照包括下述步骤的方法制
备：将牛血清白蛋白用溶剂配制成牛血清白蛋白
浓度不同的N种溶液，将所述N种溶液均分别加入
酶标板的不同孔内，包被所述酶标板，得到标准
品包被的酶标板；所述N为大于等于8的自然数；
所述溶剂为pH值为7.4的磷酸缓冲盐溶液。本发
明实现了快速、灵敏和准确地检测液体中的总蛋
白含量，可用于生物化妆品制备，抗体制备，中药
刺激细胞产生分泌物领域中的细胞培养上清液
中的蛋白质含量的检测。权利要求书1页 说明书12页 附图5页CN 109239352 A 2019.01.18
C N 109239352
A
1.用于测定细胞培养上清液中的蛋白质含量的试剂盒，包括标准品包被的酶标板和考马斯亮蓝G250染
液，所述标准品包被的酶标板按照包括下述步骤的方法制备：将牛血清白蛋白用溶剂配制成牛血清白蛋白浓度不同的N种溶液，将所述N种溶液均分别加入酶标板的不同孔内，包被所述酶标板，得到标准品包被的酶标板；所述N为大于等于8的自然数；所述溶剂为pH值为7.4的磷酸缓冲盐溶液。
2.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于：所述pH值为7.4的磷酸缓冲盐溶液是将磷酸二氢钾、磷酸氢二钠、氯化钠和氯化钾溶于水中得到的磷酸二氢钾浓度为1.76mmol/L、磷酸氢二钠浓度为25.5mmol/L、氯化钠浓度为137mmol/L和氯化钾浓度为2.7mmol/L的溶液。
3.根据权利要求1或2所述的试剂盒，其特征在于：所述N种溶液为牛血清白蛋白浓度分别为0mg/ml、0.1mg/ml、0.2mg/ml、0.4mg/ml、0.8mg/ml、1.0mg/ml、2.0mg/ml和
4.0mg/ml的溶液。
4.制备权利要求1-3中任一所述的试剂盒的方法，包括如下制备标准品包被的酶标板的步骤：将牛血清白蛋白用溶剂配置成牛血清白蛋白浓度不同的N种溶液，将所述N种溶液均分别加入酶标板的不同孔内，包被所述酶标板，得到标准品包被的酶标板；所述N为大于等于8的自然数；所述溶剂为pH值为7.4的磷酸缓冲盐溶液。
5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于：所述pH值为7.4的磷酸缓冲盐溶液是将磷酸二氢钾、磷酸氢
二钠、氯化钠和氯化钾溶于水中得到的磷酸二氢钾浓度为1.76mmol/L、磷酸氢二钠浓度为25.5mmol/L、氯化钠浓度为137mmol/L和氯化钾浓度为2.7mmol/L的溶液。
6.根据权利要求4或5所述的方法，其特征在于：所述N种溶液为牛血清白蛋白浓度分别为0mg/ml、0.1mg/ml、0.2mg/ml、0.4mg/ml、0.8mg/ml、1.0mg/ml、2.0mg/ml和4.0mg/ml的溶液。
7.根据权利要求4或5或6所述的方法，其特征在于：所述方法还包括将考马斯亮蓝G250染液和所述标准品包被的酶标板单独包装后装入试剂盒得到用于测定细胞培养上清液中的蛋白质含量的试剂盒的步骤。
8.权利要求1-3中任一权利要求所述的试剂盒在检测细胞培养上清液中的蛋白质含量中的应用。
9.根据权利要求8所述的应用，其特征在于：所述检测细胞培养上清液中的蛋白质含量为检测细胞培养上清液中的总蛋白质含量。
10.根据权利要求8或9所述的应用，其特征在于：所述细胞为动物细胞、植物细胞或微生物细胞。
权 利 要 求 书1/1页CN 109239352 A
细胞上清的总蛋白定量检测试剂盒及其制备方法与应用
技术领域
[0001]本发明涉及蛋白质含量检测领域中一种细胞上清的总蛋白定量检测试剂盒及其制备方法与应用。
背景技术
[0002]蛋白质是生命的物质基础，是有机大分子，是构成细胞的基本有机物，是生命活动的主要承担者。没有蛋白质就没有生命。氨基酸是蛋白质的基本组成单位，氨基酸通过脱水缩合形成肽链。蛋白质是由一条或多条多肽链组成的生物大分子，每一条多肽链有二十至数百个氨基酸残基不等；各种氨基酸残基按一定的顺序排列。蛋白质是与生命及与各种形式的生命活动紧密联系在一起的物质。机体中的每一个细胞和所有重要组成部分都有蛋白质参与。蛋白质占人体重量的16.3％，即一个60kg重的成年人其体内约有蛋白质9.8kg。人体内蛋白质的种类很多，性质、功能各异，但都是由20多种氨基酸按不同比例组合而成的，并在体内不断进行代谢与更新。蛋白质的不同在于其氨基酸的种类、数目、排列顺序和肽链空间结构的不同。蛋白质是机体细胞的重要组成部分，是人体组织更新和修补的主要原料。人体的每个组织：毛发、皮肤、肌肉、骨骼、内脏、大脑、血液、神经、内分泌等都是由蛋白质组成。
[0003]细胞培养上清液含有丰富多彩的分泌蛋白，比如：酶、抗体、蛋白质类的激素、细胞因子等。细胞因子是可溶性蛋白，是机体多种细胞分泌的小分子蛋白质，是由活化细胞分泌的具有高活性、多功能的主要介导和调节免疫应答及炎症反应的小分子多肽，通过结合细胞表面的相应受体发挥生物学作用，
具有调节固有免疫和适应性免疫应答，促进造血，以及刺激细胞活化，增殖，分化等功能。由于基因工程、细胞工程研究的飞速发展，不仅克隆了早先发现的生物活性肽的cDNA，而且发现了许多新的细胞因子，并对各种细胞因子产生来源、分子结构和基因、相应的受体、生物学功能以及与临床的关系等进行了大量的研究，成为当今基础免疫学和临床免疫学研究中一个活跃的领域。细胞因子对人类许多常见病、多发病及传染性疾病的作用，已经不是传统疗法(化学药物、放射、手术等)所能比拟的。细胞因子的发现、合成及其有关生物学特性已经或将要继续不断被阐明，愈来愈多的细胞因子得以商品化。比如：生物化妆品，制备抗体，中药刺激细胞产生分泌物研究领域等。
[0004]生物化妆品是指应用生物工程技术及其制品制得的化妆品，其主要成分生物活性多肽大部分是细胞生长因子，它们在体内含量极微，但生物活性极高，对多种细胞生理功能和代谢活动发挥生物调节作用，直接或间接地影响多种类型细胞的生长、分裂、分化、增殖和迁移，在美容护肤、整形外科、烧伤溃疡以及各种皮肤病的伤口修复与愈合中有重要作用。细胞生长因子经过稳定的结构修饰或特殊的保护处理后，以一定的有效浓度添加到化妆品中，可以有效地与皮肤细胞发生作用，促进上皮细胞营养代谢，保护皮肤，预防由于各种原因导致的皮肤损伤。正常护肤品中添加活性细胞生长因子还可以有效地促进皮下胶原细胞的功能，加速皮肤胶原细胞的生长，使细胞加速分泌胶原，从而达到抗皱及延缓衰老的
作用。
[0005]由免疫反应抗原刺激机体后，产生的特异性反应，包括细胞免疫、体液免疫，表现为免疫细胞分裂繁殖，产生淋巴因子，合成并分泌抗体。对于免疫细胞化学的技术关键之一是制备特异性强、亲合力大、滴度高的特异性抗体。
[0006]由细胞自体产生的分泌蛋白，或由于药物或外来条件刺激细胞产生的分泌到培养基中蛋白质目前已经越来越多的商品化，研发测定细胞培养上清液中总蛋白含量的检测试剂盒可以更好的监测这类产品的质量。
发明内容
[0007]本发明所要解决的技术问题是如何快速、灵敏和/或准确地测定细胞培养上清液中的总蛋白质含量。
[0008]为了解决以上技术问题，本发明提供了测定细胞培养上清液中的蛋白质含量的试剂盒。
[0009]本发明所提供的用于测定细胞培养上清液中的蛋白质含量的试剂盒，包括标准品包被的酶标板和考马斯亮蓝G250染液，所述标准品包被的酶标板按照包括下述步骤的方法制备：将牛血清白蛋白用溶剂配制成牛血清白蛋白浓度不同的N种溶液，将所述N种溶液均分别加入酶标板的不同孔内，包被所述酶标板，得到标准品包被的酶标板；所述N为大于等于8的自然数；所述溶剂为pH值为7.4的磷酸缓冲盐溶液。
[0010]上述试剂盒中，所述pH值为7.4的磷酸缓冲盐溶液可为将磷酸二氢钾、磷酸氢二钠、氯化钠和氯化钾溶于水(如双蒸水)中得到的磷酸二氢钾浓度为1.76mmol/L、磷酸氢二钠浓度为25.5mmol/L、氯化钠浓度为137mmol/L和氯化钾浓度为2.7mmol/L的溶液。[0011]上述试剂盒中，所述N种溶液可为牛血清白蛋白浓度分别为0mg/ml、0.1mg/ml、0.2mg/ml、0.4mg/ml、0.8mg/ml、1.0mg/ml、2.0mg/ml和4.0mg/ml的溶液。
[0012]制备上述试剂盒的方法也属于本发明的保护范围。
[0013]本发明所提供的制备上述试剂盒的方法，可包括如下制备标准品包被的酶标板的步骤：将牛血清白蛋白用溶剂配置成牛血清白蛋白浓度不同的N种溶液，将所述N种溶液均分别加入酶标板的不同孔内，包被所述酶标板，得到标准品包被的酶标板；所述N为大于等于8的自然数；所述溶剂为pH值为7.4的磷酸缓冲盐溶液。
[0014]上述方法中，所述pH值为7.4的磷酸缓冲盐溶液可为将磷酸二氢钾、磷酸氢二钠、氯化钠和氯化钾溶于水(如双蒸水)中得到的磷酸二氢钾浓度为1.76mmol/L、磷酸氢二钠浓度为25.5mmol/L、氯化钠浓度为137mmol/L和氯化钾浓度为2.7mmol/L的溶液。
[0015]上述方法中，所述N种溶液可为牛血清白蛋白浓度分别为0mg/ml、0.1mg/ml、0.2mg/ml、0.4mg/ml、0.8mg/ml、1.0mg/ml、2.0mg/ml和4.0mg/ml的溶液。
[0016]上述方法中，所述方法还包括将考马斯亮蓝G250染液和所述标准品包被的酶标板单独包装后装入试剂盒得到用于测定细胞培养上清液中的蛋白质含量的试剂盒的步骤。[0017]上文中，包被所述酶标板可在4℃放置8-12小时。
[0018]上述试剂盒在检测细胞培养上清液中的蛋白质含量中的应用也属于本发明的保护范围。
[0019]上述应用中，所述检测细胞培养上清液中的蛋白质含量可为检测检测细胞培养上
清液中的总蛋白质含量。
[0020]上述应用中，所述细胞可为动物细胞、植物细胞或微生物细胞。
[0021]上述应用中，所述动物细胞可为哺乳动物细胞，如鼠或人。
[0022]上述应用中，所有应用的直接目的可以是非疾病目的、非疾病预后目的和/或非疾病诊断目的。
[0023]本发明根据考马斯亮蓝法(Bradford法)开发了用于测定细胞培养上清液中的蛋白质含量的试剂盒，其原理是考马斯亮蓝(Coommassie Brilliant Blue)G-250与蛋白质的碱性和芳香族氨基酸特别是精氨酸(Arginine)在酸性介质中结合后，溶液转变为蓝，溶液最大吸收峰从465nm迁移到595nm，颜的变化
与蛋白质浓度成正比。因此，可通过检测595nm处的吸光度对溶液中蛋白质浓度进行测定。众所周知，蛋白质的不稳定性在很大程度上限制了其广泛的应用，其影响因素较多，主要是pH，无机盐和有机溶剂等通过改变蛋白质的物理、化学性质，进一步对其稳定性造成不同程度的影响。因此，研究pH，无机盐和有机溶剂对蛋白质稳定性的影响及其热稳定性实验(37℃加速试验)对该试剂盒是至关重要的。本发明采用上述pH值为7.4的磷酸缓冲盐溶液作为溶剂制备牛血清白蛋白包被的标准品包被的酶标板，实现了快速、灵敏和准确地检测液体中的总蛋白含量。本发明可用于生物化妆品制备，抗体制备，中药刺激细胞产生分泌物领域中的细胞培养上清液中的蛋白质含量的检测。
附图说明
[0024]图1为标准曲线。
[0025]图2为用实施例1的用于测定细胞培养上清液中的蛋白质含量的试剂盒检测人脐带间充质干细胞培养上清液及不同滤膜处理样品中的蛋白质含量的差异显著性分析。[0026]图3为用实施例1的用于测定细胞培养上清液中的蛋白质含量的试剂盒的热稳定性实验的各处理组的回归曲线。
[0027]图4为蛋白质含量随pH的变化曲线。
[0028]图5为蛋白质含量随氯化钠浓度的变化曲线。
[0029]图6为蛋白质含量随硫酸铵浓度的变化曲线。
[0030]图7为蛋白质含量随乙腈浓度的变化曲线。
[0031]图8为蛋白质含量随甲醇浓度的变化曲线。
[0032]图9为蛋白质含量随葡萄糖浓度的变化曲线。
具体实施方式
[0033]下面结合具体实施方式对本发明进行进一步的详细描述，给出的实施例仅为了阐明本发明，而不是为了限制本发明的范围。以下提供的实施例可作为本技术领域普通技术人员进行进一步改进的指南，并不以任何方式构成对本发明的限制。
[0034]下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
[0035]实施例1、用于测定细胞培养上清液中的蛋白质含量的试剂盒的制备
[0036]本实施例提供的用于测定细胞培养上清液中的蛋白质含量的试剂盒，组成为：一
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