(19)中华人民共和国国家知识产权局
(12)发明专利申请
(10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请号 201811214590.2
(22)申请日 2018.10.18
(71)申请人 北京博奥晶典生物技术有限公司
地址 101111 北京市大兴区北京经济技术
开发区科创六街88号院10号楼101室
(72)发明人 王莹莹 尹经逵 陈军 许俊泉
(74)专利代理机构 北京纪凯知识产权代理有限
公司 11245
代理人 关畅 魏少伟
(51)Int.Cl.
C12N 15/10(2006.01)
C12N 5/071(2010.01)
C12Q 1/6806(2018.01)
C40B 50/06(2006.01)
(54)发明名称
法
(57)摘要
本发明公开了外泌体的制备及构建外泌体
RNA文库的方法，包括：利用制备外泌体的方法得
到外泌体；所述制备外泌体的方法包括：利用截
留分子量为3KD的滤膜对含有外泌体的液体中的
浓缩后的样品中外泌体即得到外泌体；提取外泌
体RNA，得到外泌体总RNA；利用所述外泌体总RNA
制备得到外泌体小RNA文库。本发明不仅可以富
积多种体液及细胞上清液中外泌体，并完成低起
始量小RNA的建库。权利要求书2页 说明书10页 附图5页CN 109321563 A 2019.02.12 C N 109321563
A
1.构建外泌体小RNA文库的方法，包括：
1)利用制备外泌体的方法得到外泌体；
所述制备外泌体的方法包括：利用截留分子量为3KD的滤膜对含有外泌体的液体中的外泌体进行浓缩，得到浓缩后的样品；提取所述浓缩后的样品中外泌体即得到外泌体；
2)提取外泌体RNA，得到外泌体总RNA；
3)利用所述外泌体总RNA制备得到外泌体小RNA文库。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述含有外泌体的液体为体液或细胞上清液。
3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于：所述体液为血液、血浆、血清、唾液、尿液、乳汁、脑脊液、羊水或腹水。
4.根据权利要求1-3中任一所述的方法，其特征在于：所述利用截留分子量为3KD的滤膜对含有外泌体的液体中的外泌体进行浓缩通过利用含有所述滤膜的超滤管进行。
5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于：利用所述超滤管浓缩所述含有外泌体的液体中的外泌体的离心力为4000-5000×g；
和/或，利用所述超滤管浓缩所述含有外泌体的液体中的外泌体的离心时间为10-60分钟；
和/或，利用所述超滤管浓缩所述含有外泌体的液体中的外泌体在4℃下进行。
6.根据权利要求1-5中任一所述的方法，其特征在于：提取所述浓缩后的样品中外泌体包括a1)和a2)：
a1)沉淀所述浓缩后的样品中的外泌体，得到混合液；
a2)将所述混合液离心，使外泌体进入沉淀中，即得到外泌体。
7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于：步骤a1)通过向所述浓缩后的样品中添加外泌体沉降剂完成；
和/或，步骤a2)中所述离心的离心力为1500×g；
和/或，步骤a2)中所述离心的离心时间为30min；
和/或，步骤a2)中所述离心在4℃下进行。
8.下述X1)或X2)的方法：
X1)权利要求1-7中任一所述制备外泌体的方法；
X2)制备外泌体RNA的方法，包括：按照权利要求1-7中任一所述制备外泌体的方法得到外泌体，提取外泌体的RNA即得到外泌体RNA。
9.成套产品，由下述Y1)或Y2)组成：
Y1)权利要求1-4中任一所述截留分子量为3KD的滤膜或所述超滤管；
Y2)权利要求7所述外泌体沉降剂。
10.下述任一应用：
Z1)权利要求1-7中任一所述构建外泌体小RNA文库的方法在外泌体小RNA测序中的应用；
Z2)权利要求1-7中任一所述制备外泌体的方法在外泌体小RNA测序中的应用；
Z3)权利要求1-7中任一所述制备外泌体的方法在构建外泌体小RNA文库中的应用；
Z4)权利要求1-7中任一所述制备外泌体的方法在制备外泌体RNA中的应用；
Z5)权利要求8中所述制备外泌体RNA的方法在外泌体小RNA测序中的应用；
Z6)权利要求8中所述制备外泌体RNA的方法在构建外泌体小RNA文库中的应用；Z7)权利要求9所述成套产品在外泌体小RNA测序中的应用；
Z8)权利要求9所述成套产品在构建外泌体小RNA文库中的应用；
Z9)权利要求9所述成套产品在制备外泌体RNA中的应用；
Z10)权利要求9所述成套产品在制备外泌体中的应用。
外泌体的制备及构建外泌体小RNA文库的方法
技术领域
[0001]本发明涉及生物技术领域中，外泌体的制备及构建外泌体小RNA文库的方法。
背景技术
[0002]1983年，外泌体首次于绵羊网织红细胞中被发现，1987年Johnstone将其命名为外泌体“exosome”。现今，其特指直径在40-100nm的盘状囊泡。外泌体主要来源于细胞内溶酶体微粒内陷形成的多囊泡体，经多囊泡体外膜与细胞膜融合后释放到胞外基质中，其具有在细胞之间传递信息的功能。不同的细胞分泌的外泌体可能包含特异性的蛋白质、DNA和RNA。研究表明在血液(血清、血浆)、尿液、乳汁、羊水、恶性肿瘤腹水等体液以及所有培养的细胞上清中均存在外泌体。
[0003]外泌体中主要的遗传物质是RNA(miRNA、LncRNA、CircRNA)，其中90％都是小RNA。目前外泌体小RNA高通量测序研究中的一个难点是外泌体的富积与外泌体RNA的提取，因为现有方法提取出的外泌体RNA很难满足传统小RNA的建库的要求。
[0004]目前存在的分离外泌体的方法主要有以下几种：
[0005]第一种方法是利用不同的超速离心速度(Théry C et al.Curr Protoc Cell Biol,2006；3:1–29)或者是密度梯度离心(Tauro BJ et al.Methods 2012；56:293–304.)。目前该方法是被认为是外泌体分离的金标
准，用此方法分离的外泌体的纯度高，但此方法提取出的外泌体RNA含量非常低，且超速离心机价格昂贵无法普及，并且此方法提取的外泌体结构可能被破坏(Linares R et al.J Extracell Vesicles2015；4:29509)。
[0006]第二种方法是超滤法(Merchant ML et al.Proteomics-Clin Appl 2010；4:84–96)。此方法虽然操作简单。但是得到的外泌体的纯度不高(Danqi Wang and Wei Sun, Proteomics,2014；14,1922-1932)。
[0007]第三种方法是商品化的试剂盒，此种方法，可以分为两类，一类是将抽提试剂加入到样品中，离心得到外泌体的沉淀(Lobb RJ et al.J Extracell Vesicles2015；4: 27031)，另一类方法是将样品加入到柱子中(Bo AN et al.J Extracell Vesicles2014；3: 23430)，在通过柱子的过程中，样品中的蛋白质等杂质会进入到柱子中，而粒径较大的外泌体会先从柱子中流出，这样能较快速的得到纯度较高的外泌体。市售试剂盒虽然提取的外泌体纯度没有超速离心法纯度高，但是对于普通的RNA研究可以满足，且提取操作简单，时间短。但是，有一些复杂样本，例如尿液、乳汁、细胞上清，从少量的上述样本中提取的外泌体的量实在太少，无法达到一些大规模筛选或表达检测的实验要求，而且，市售的试剂盒价格昂贵，一瓶50mL的外泌体提取液售价达4000多元，而提取过程中要求体液与试剂的比例是1:1，这样要提取到满足后续检测测序要求的外泌体的费用太高，在实际中很难推广应用，很大层度限制了这种方法的应用；血浆、血清外泌体富积也是存在同样的问题，不仅提取试剂昂贵，而且一般需要5mL血浆用于外泌体的富积，不可避免地需要病人抽取大量血液，给病人带来痛苦。
发明内容
[0008]本发明所要解决的技术问题是如何制备外泌体以及构建外泌体小RNA文库。[0009]为解决上述技术问题，本发明首先提供了构建外泌体小RNA文库的方法，所述方法包括：
[0010]1)利用制备外泌体的方法得到外泌体；
[0011]所述制备外泌体的方法包括：利用截留分子量为3KD的滤膜对含有外泌体的液体中的外泌体进行浓缩，得到浓缩后的样品；提取所述浓缩后的样品中外泌体即得到外泌体；[0012]2)提取外泌体RNA，得到外泌体总RNA；
[0013]3)利用所述外泌体总RNA制备得到外泌体小RNA文库。
[0014]上述方法中，所述含有外泌体的液体可为体液或细胞上清液。
[0015]所述细胞上清液具体为培养动物细胞(如A549肺腺癌细胞系)得到的上清液。[0016]上述方法中，所述体液具体可为血液、血浆、血清、唾液、尿液、乳汁、脑脊液(CSF)、羊水或腹水。
[0017]上述方法中，所述利用截留分子量为3KD的滤膜对含有外泌体的液体中的外泌体进行浓缩可通过利用含有所述滤膜的超滤管进行。
[0018]所述超滤管具体可为millipore默克密理博(Merck Millipore)产品。所述超滤管的过滤器的容积可根据具体需要选择。在本发明的一个实施例中，所述超滤管的过滤器的容积为15mL。
[0019]上述方法中，利用所述超滤管浓缩所述含有外泌体的液体中的外泌体的离心力可为4000-5000×g。
[0020]利用所述超滤管浓缩所述含有外泌体的液体中的外泌体的离心时间可为10-60分钟。
[0021]利用所述超滤管浓缩所述含有外泌体的液体中的外泌体在4℃下进行。
[0022]上述方法中，提取所述浓缩后的样品中外泌体可包括a1)和a2)：
[0023]a1)沉淀所述浓缩后的样品中的外泌体，得到混合液；
[0024]a2)将所述混合液离心，使外泌体进入沉淀中，即得到外泌体。
[0025]上述方法中，步骤a1)可通过向所述浓缩后的样品中添加外泌体沉降剂完成。所述外泌体沉降剂可为上海吉泰依科赛生物科技有限公司的E x o Q u i c k E x o s o m e Precipitation Solution(货号为EXOQ5A)，或，上海吉泰依科赛生物科技有限公司的ExoQuick-TC for Tissue Culture Media and Urine(货号为EXOTC10A-1)。
[0026]步骤a2)中所述离心的离心力可为1500×g。
[0027]步骤a2)中所述离心的离心时间可为30min。
[0028]步骤a2)中所述离心可在4℃下进行。
[0029]所述含有外泌体的液体可为血液、血浆、血清、唾液、乳汁或脑脊液(CSF)，所述外泌体沉降剂为上海吉泰依科赛生物科技有限公司的ExoQuick Exosome Precipitation Solution，货号为EXOQ5A。
[0030]所述含有外泌体的液体为尿液、所述细胞上清液、羊水或腹水，所述外泌体沉降剂为上海吉泰依科赛生物科技有限公司的ExoQuick-TC for Tissue Culture Media and Urine，货号为EXOTC10A-1。
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