(10)申请公布号 CN 102190722 A
(43)申请公布日 2011.09.21C N 102190722 A
*CN102190722A*
(21)申请号 201010124935.2
(22)申请日 2010.03.16
C07K 14/765(2006.01)
C07K 1/22(2006.01)
C07K 1/20(2006.01)
C07K 1/18(2006.01)
C07K 1/16(2006.01)
(71)申请人上海安睿特生物医药科技有限公司
地址201203 上海市张江高科技园区牛顿路
200号8号楼2层A 座-03座
(72)发明人项炜 朱威 陈忠
(74)专利代理机构上海专利商标事务所有限公
司 31100
代理人陈静
(54)发明名称
(57)摘要
本发明涉及一种纯化重组人血白蛋白(rHSA)
的方法。该方法包括将发酵液不经处理，直接用扩
张床阴离子柱一步层析达到固液分离、浓缩和初
步纯化的三个层析纯化作用。再经过加热、
疏水层析、阳离子交换、超滤、螯合、沉淀等步骤获得超高
纯度的重组人血白蛋白。(51)Int.Cl.
(19)中华人民共和国国家知识产权局(12)发明专利申请
权利要求书 1 页 说明书 8 页 附图 2 页
1.一种纯化重组人血清白蛋白的方法，其特征在于，所述方法包括：
(a)将含有重组人血清白蛋白的发酵液上样到含有吸附剂的流化床，使得吸附剂选择性吸附所述重组人血清白蛋白；其中，所述的吸附剂是阴离子交换树脂；以及
(b)回收被吸附的重组人血清白蛋白。
2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，上样前，将所述的含有吸附剂的流化床调节pH7.0-8.0；或
上样后，将吸附了所述重组人血清白蛋白的含有吸附剂的流化床调节pH7.0-8.0。
3.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的阴离子交换树脂是Streamline阴离子交换树脂。
4.如权利要求3所述的方法，其特征在于，所述的Streamline阴离子交换树脂选自：Streamline Q，Streamline Q XL，或Streamline DEAE。
5.如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(b)中，还包括：依次采用以下方法进一步纯化：(1)疏水层析；(2)脱；(3)葡聚糖凝胶过滤；(4)阴离子交换树脂层析。
6.如权利要求5所述的方法，其特征在于，步骤(2)中包括：
(i)采用硼酸或硼酸盐和二价金属离子处理经疏水层析的样液，然后加热至60±20℃，过滤收获滤过液；和
(ii)将滤过液进行大孔树脂脱，得到经脱的样液。
7.如权利要求6所述的方法，其特征在于，在(i)和(ii)之间，还包括步骤：对滤过液进行超滤。
8.如权利要求6所述的方法，其特征在于，二价金属离子选自：Ca2+或Mg2+；或
硼酸或硼酸盐的浓度为1～500mM；或
二价金属离子的浓度在1～500mM之间。
9.如权利要求5所述的方法，其特征在于，所述的大孔树脂是含有氨基和羟基的共聚高分子多孔树脂。
10.如权利要求5所述的方法，其特征在于，疏水层析的配基选自：苯基，脂肪族或杂环。
一种纯化重组人血白蛋白的方法
技术领域
[0001] 本发明属于生物技术领域；更具体地，本发明涉及一种纯化重组人血白蛋白(rHSA)的方法。
背景技术
[0002] 人血清白蛋白是血浆中的主要蛋白成分，由585个氨基酸组成，分子量为66kD。人血清白蛋白在血液中主要作用是维持正常渗透压，与钙离子、脂肪酸、氨基酸、胆红素和各种药物相结合，并起到转运载体的作用。临床上人血清白蛋白常用于外科手术、出血性休克、烫伤、肾病综合征导致的白蛋白缺乏症、肿瘤肝腹水等疾病的。
[0003] 一直以来，人血清白蛋白是从人血液中纯化得到的。由于血源匮乏和病毒(肝炎、AIDS)污染等原因，基因重组人血清白蛋白在近十年中得到了国内外大型制药公司的重视。近年来，采用基因重组的方法，在酵母菌(USP5,330,901、JP11-509525、JP6-100592)、大肠杆菌(Lawn，R.M.Construction of DNA sequencesand their use for microbial production of proteins，in particular human serumalbumin“European Patent Appl.”(1983)73，p646)、转基因牛奶(WO9602573A1SEPARATION OF HUMAN SERUM ALBUMIN)中表达和纯化出人血清白蛋白。
[0004] 然而，人血清白蛋白的临床中的给药剂量较大，一般情况下为5～10g/剂量之间，所以与微量给药的常规重组药物相比，杂质产生的副作用成为十分严重问题。因此，对于基因重组白蛋白比目前市场上的人血清白蛋白和其他基因重组药品的制剂的纯度要高度多。到目前为止仅有日本三菱制药株式会社的毕赤酵母发酵的rHSA在2008年上市，商品名：解决rhSA的主要难点，就是建立超高纯度(纯度高于99％)和良好的经济性(成本不高于血液纯化的白蛋白)rHSA的制备方法。
[0005] 野田宗宏等人在专利CN1127299A和CN1364643A中描述了酵母发酵后利用加热发酵液、稀释、调酸、扩张床阳离子(STREAMLINE SP-GE Healthcare公司专为扩张床设计的商品化树脂)层析、加热、疏水层析、螯合吸附、阴离子交换、硼酸钙沉淀等步骤得到高纯度rHSA的方法。该方法中，第一步加热的目的是灭活蛋白酶，否则阳离子交换树脂需要的酸性条件将激活蛋白酶的活性，从而在纯化过程中降解rHSA。该方法稀释的目的是降低离子强度以达到Streamline SP能够吸附的效果。但是，该方法的缺点是加热灭活使得过程延长；调酸激活蛋白酶活性导致rHSA降解风险；大体积稀释使得纯化的溶液体积增加，从而需要扩大纯化设备的规模，纯化过程延长。这样将导致rHSA产品的收率减少，成本增加，产品的品质有可能下降，产品染菌的风险增加等等问题。
[0006] 柴田伸一等人在中国专利CN1934128A中公开了一种在2价阳离子存在下通过加热处理制备人血清白蛋白的方法，野内俊伸等人在中国专利CN1406246A中公开了包括加热处理步骤的人血清白蛋白的制造方法。
[0007] 然而，上述方法均存在处理条件复杂，固液分离效率不高，获得的产物纯度不高等缺点。因此，目前还需要进一步开发更理想的纯化重组人血清白蛋白的方法，以满足生产所
需和临床所需。
发明内容
[0008] 本发明的目的在于提供一种纯化重组人血白蛋白(rHSA)的方法。
[0009] 在本发明的第一方面，提供一种纯化重组人血清白蛋白的方法，所述方法包括：[0010] (a)将含有重组人血清白蛋白的发酵液上样到含有吸附剂的流化床，使得吸附剂选择性吸附所述重组人血清白蛋白；其中，所述的吸附剂是阴离子交换树脂；以及
[0011] (b)回收被吸附的重组人血清白蛋白。
[0012] 在一个优选例中，在进入含有吸附剂的流化床前，所述的含有重组人血清白蛋白的发酵液不经过加热处理。
[0013] 在另一优选例中，上样前，将所述的含有吸附剂的流化床调节pH7.0-8.0；较佳地，用缓冲液平衡至pH7.0-8.0；或
[0014] 上样后，将吸附了所述重组人血清白蛋白的含有吸附剂的流化床调节pH7.0-8.0；较佳地，用pH7.0-8.0的缓冲液清洗。
[0015] 在另一优选例中，上样前，所述的含有吸附剂的流化床调节pH7.0-7.5；或上样后，吸附了所述重组人血清白蛋白的含有吸附剂的流化床调节pH7.0-7.5。
[0016] 在另一优选例中，所述的阴离子交换树脂是Streamline阴离子交换树脂。[0017] 在另一优选例中，所述的Streamline阴离子交换树脂选自：Streamline Q，Streamline Q XL，或Streamline DEAE。
[0018] 在另一优选例中，步骤(b)中，还包括：依次采用以下方法进一步纯化：(1)疏水层析；(2)脱；(3)葡聚糖凝胶过滤；(4)阴离子交换树脂层析。
[0019] 在另一优选例中，步骤(2)中包括：
[0020] (i)采用硼酸或硼酸盐和二价金属离子处理经疏水层析的样液，然后加热至60±20℃；较佳地60±10℃；更佳地60±5℃。较佳地，加热2±1小时，过滤收获滤过液；[0021] (ii)将滤过液进行大孔树脂脱，得到经脱的样液。
[0022] 在另一优选例中，在(i)和(ii)之间，还包括步骤：对滤过液进行超滤。[0023] 在另一优选例中，二价金属离子选自：Ca2+或Mg2+；或
[0024] 硼酸或硼酸盐的浓度为1～500mM；较佳地为10～200mM；更佳地为50±20mM；最佳地为50±10mM；或
[0025] 二价金属离子的浓度在1～500mM之间；较佳地为10～80mM；更佳地为30±20mM；最佳地为30±10mM。
[0026] 在另一优选例中，所述的大孔树脂是含有氨基和羟基的共聚高分子多孔树脂。[0027] 在另一优选例中，疏水层析的配基选自：苯基，脂肪族或杂环。
[0028] 在另一优选例中，疏水层析的纯化方式为流穿。
[0029] 在另一优选例中，所述的葡聚糖凝胶过滤采用Superdex系列或Sephadex G系列。更佳地，所述的葡聚糖凝胶Sephadex G75。
[0030] 在另一优选例中，阴离子交换树脂层析的树脂包括：DEAE、QAE、Q配基。
[0031] 本发明的其它方面由于本文的公开内容，对本领域的技术人员而言是显而易见的。
附图说明
[0032] 图1、扩张床Streamline Q XL处理后rHSA的样品峰。
[0033] 图2、Phenyl Sepharose(H Sub)疏水层析后rHSA的样品峰。
[0034] 图3、大孔脱树脂XSC700处理后rHSA的样品峰。
[0035] 图4、DEAE Sepharose FF阴离子层析处理后rHSA的样品峰。
具体实施方式
[0036] 本发明人经过广泛的研究，开发出一种将发酵液不经加热处理，直接用含有吸附剂(阴离子树脂)的流化床进行固液分离，再经过多个纯化步骤获得超高纯度的重组人血白蛋白的方法。
[0037] 如本文所用，所述的重组人血清白蛋白(rHSA)是指通过重组技术产生的人血清白蛋白。即将编码人血清白蛋白的DNA导入到合适的宿主细胞中，在适于表达的条件下培养该细胞，从而产生重组人血清白蛋白。所述的宿主细胞选自：细菌(如大肠杆菌和枯草杆菌)，酵母(如啤酒酵母、巴斯德毕赤酵母和克鲁维氏等)，植物细胞，动物细胞。优选的微生物是巴斯德毕赤酵母。较佳地，所述的重组人血清白蛋白被分泌到胞外。
[0038] 本发明提供一种纯化重组人血清白蛋白的方法，所述方法包括：(a)将含有重组人血清白蛋白的发酵液上样到含有吸附剂的流化床，使得吸附剂选择性吸附所述重组人血清白蛋白；其中，所述的吸附剂是阴离子交换树脂；以及(b)回收被吸附的重组人血清白蛋白。
[0039] 本发明人发现，在固液分离前进行加热处理，会导致杂质凝集，不利于后续的分离，且去除凝集物的步骤也很复杂，直接影响到提取率以及纯化效果。此外，在固液分离前进行酶抑制剂处理，会导致成本大大提高(酶抑制剂价格高昂)，以及引入外部污染物的结果。而本发明的方法不同于现有技术中常规的纯化方法，在进入含有吸附剂的流化床前，所述的含有重组人血清白蛋白的发酵液不经过加热处理，
也不经过酶抑制剂处理。[0040] 所述的含有吸附剂的流化床中，吸附剂是阴离子交换树脂，较佳地是Streamline 阴离子树脂。其在碱性条件下对rHSA有很好的吸附和分离性能，不需要对弱碱性的发酵液进行调酸，因而不会激活蛋白酶造成对目标蛋白的降解，同时也避免了酸性条件下rHSA 的聚合反应。采用碱性条件还可以节省以后纯化过程中的解聚合步骤。因此，上样前，将所述的含有吸附剂的流化床调节pH7.0-8.0；较佳地，用缓冲液平衡至pH7.0-8.0；更佳地调节pH7.0-7.5；或上样后，将吸附了所述重组人血清白蛋白的含有吸附剂的流化床调节pH7.0-8.0；较佳地，用pH7.0-8.0的缓冲液清洗；更佳地调节pH7.0-7.5。
[0041] 所述的Streamline阴离子交换树脂选自：Streamline Q，Streamline Q XL，或Streamline DEAE。更佳地，所述的Streamline阴离子树脂优选Sreamline XL阴离子树脂(GE Healthcare公司)，该树脂的蛋白载量提高的将近5～10倍，在较宽的pH范围内和高离子强度下都有很好的吸附性能。
[0042] 固液分离之后，还可以对获得的重组人血清白蛋白进行进一步的纯化，可以采用本领域技术人员熟知的多种蛋白纯化方法进行。
[0043] 本发明人对固液分离之后的蛋白纯化也进行了深入的研究和优化，到了较佳的
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