PCR技术及注意事项
背景
PCR:聚合酶链式反应(PolymeraeChainReaction)是一种用于放大扩增特定的DNA片段的分子生物学技术。 1971Khorana等最早提出核酸体外扩增的设想；1983年Mulli发明并申请专利。
原理
根据DNA的半保留复制。相关酶
双链DNA
单链
DNA聚合酶碱基互补配对
复制
两分子拷贝。
在体外实验中，DNA在高温时也可以发生变性解链，当温度降低后又可以复性成为双链。因此，通过温度变化控制DNA的变性和复性，加入设计引物，DNA聚合酶、dNTP就可以完成特定基因的体外复制。 反应体系
缓冲液4种dNTP混合物(终浓度)引物(终浓度)模板DNATaqDNA聚合酶(耐热DNA聚合酶--Taq酶的发现对于PCR的应用有里程碑的意义，该酶可以耐受90℃以上的高温而不失活，不需要每个循环加酶，使PCR技术变得非常简捷、同时也大大降低了成本。) Mg2+(终浓度)双蒸水
步骤
变性--退火--延伸三个基本反应步骤构成。①模板DNA的变性：模板DNA经加热至93℃左右一定时间后，使模板DNA双链或经PCR扩增形成的双链DNA解离，使之成为单链，以便它与
引物结合，为下轮反应作准备；②模板DNA与引物的退火(复性):模板DNA经加热变性成单链后，温度降至55℃左右，引物与模板DNA单链的互补序列配对结合；③引物的延伸：DNA模板--引物结合物在72℃、DNA聚合酶(如TaqDNA聚合酶)的作用下，以dNTP为反应原料，靶序列为模板，按碱基互补配对与半保留复制原理，合成一条新的与模板DNA链互补的半保留复制链。重复循环变性--退火--延伸三过程就可获得更多的“半保留复制链”,而且这种新链又可成为下次循环的模板。每完成一个循环需2~4分钟，2~3小时就能将待扩目的基因扩增放大几百万倍。
分类
RT-PCR:首先提起RNA,然后用逆转录酶与mRNA为模板进行cDNA第一链的合成，然后的原理和PCR就一样了！RT-PCR是个半定量的实验，可以确定在mRNA水平的表达差异。
免疫PCR(immunopolymeraechainreaction,IPCR)原理：是用一段已知DNA分子标记抗体作为探针,用此探针与待测抗原反应,PCR扩增粘附在抗原抗体复合物上的这段DNA分子,电泳定性,根据特异性PCR产物的有无,来判断待测抗原是否存在。
巢式PCR:是用内外两对引物扩增拷贝数较低的片段。先用外引物进行第一轮反应,将产物适当的稀释,然后用内引物继续扩增.比较适合微量DNA或者石蜡组织抽提的DNA
分类
原位PCR技术：原位PCR就是在组织细胞里进行PCR反应，它结合了具有细胞定位能力的原位杂
交和高度特异敏感的PCR技术的优点，是细胞学科研与临床诊
断领域里的一项有较大潜力的新技术.。
实时荧光PCR:利用荧光来检测PCR产物，PCR每循环一次就收集一个数据，通
过实时扩增曲线，准确确定CT值，从而确定DNA拷贝数
除此之外，还有锚定PCR、反向PCR、不对称PCR、长距离PCR、降落伞PCR、梯度PCR等30几种PCR。
注意事项
模板：避免污染，提高质量，浓度适宜(25-100ng)。浓度过高增加非特异性；浓度过低会降低扩增效率，使PCR产物量少。
引物：设计得当，特异性高。长度：15-30bp碱基：G+C含量以40-60%为宜，G+C太少扩增效果不佳，G+C过多易出现非特异条带。ATGC最好随机分布，避免5个以上的嘌呤或嘧啶核苷酸的成串排列。避免引物内部出现二级结构，避免两条引物间互补，特别是3‘端的互补，否则会形成引物二聚体，产生非特异的扩增条带。
引物二聚体
引物3’端的碱基，特别是最末及倒数第二个碱基，应严格要求配对，以避免因末端碱基不配对而导致PCR失败。引物的特异性：引物应与核酸序列数据库的其它序列无明显同源性。尤其避免错配！引物量：每条引物的浓度0.1~1umol或10~100pmol,以最低引物量产生所需要的结果为好，引物浓度偏高会引起错配和非特异性扩增，且可增加引物之间形成二聚体的机会。必要时，引物上可以加入合适的酶切位点，有利于分子克隆。
dNTP:多次冻融会使dNTP降解。在PCR反应中，dNTP应为50~200umol/L,浓度过低会降低PCR产物的产量。尤其是注意4种dNTP的浓度要相等(等摩尔配制),如其中任何一
种浓度不同于其它几种时(偏高或偏低),就会引起错配。
Taq酶：扩增产物随酶用量的增加，呈增多的趋势。浓度在10-15U效果较好。若太高，则降低扩增的特异性；若太低，则会影响PCR扩增反应。
Mg2+:作用是1.促进polymerae的活性；2.核苷酸进入聚合酶的活性中心也需要镁离子来消除dna骨架上磷酸基团的负电荷。浓度过高可降低PCR扩增的特异性，浓度过低则影响PCR扩增产量甚至
使PCR扩增失败而不出扩增条带。
温度：变性温度：达不到变性温度就不会产生单链DNA模板，PCR也就不会启动。变性温度低则变性不完全，DNA双链会很快复性，因而减少产量。一般取90~95℃。样品一旦到达此温度宜迅速冷却到退火温度。DNA变性只需要几秒种，时间过久没有必要；反之，在高温时间应尽量缩短，以保持TaqDNA聚合酶的活力，加入TaqDNA聚合酶后最高变性温度不宜超过95℃。
退火温度：温度高特异性强，但过高则引物不能与模板牢固结合，DNA扩增效率下降；温
度低产量高，但过低可造成引物与模板错配，非特异性产物增加。一般先由37℃反应条件开始，设置一系列对照反应，以确定某一特定反应的最适退火温度。
延伸温度：引物延伸温度温度的选择取决于TaqDNA聚合酶的最适温度。一般取70~75℃,在72℃时酶催化核苷酸的标准速率可达35~100个核苷酸/秒。每分钟可延伸1kb的长度，其速度取决于缓冲溶液的组成、pH值、盐浓度与
DNA模板的性质。
循环数：循环数过少，PCR产物得率低；循环数过多，增加非特异性。循环次数常规PCR一般为25~40个周期。在保证产物得率前提下，应尽量减少循环次数。
QPCR
实时检测(在对数扩增时期)而不是终点检测敏感性高需要样品少特异性高(Taqman)精确定量
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