(19)中华人民共和国国家知识产权局
(12)发明专利申请
(10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请号 202010699202.5
(22)申请日 2020.07.20
(83)生物保藏信息
CGMCC No.20114 2020.06.19
(71)申请人 广东南芯医疗科技有限公司
地址 510000 广东省广州市黄埔区瑞和路
83号
申请人 佛山市朗芯生物科技有限公司
(72)发明人 张召 郑康帝 赵笑笑 马燕
陈涛
(74)专利代理机构 北京慕达星云知识产权代理
事务所(特殊普通合伙)
11465
代理人 王敏
(51)Int.Cl.C12N 1/20(2006.01)A61K 35/745(2015.01)A61P 3/04(2006.01)A61P 3/06(2006.01)C12R 1/01(2006.01)
(54)发明名称一株动物双歧杆菌NX-6及其在制备降脂物中的应用(57)摘要本发明公开了一株动物双歧杆菌NX -6及其在制备降脂物中的应用，属于微生物技术领域。本发明公开的一株动物双歧杆菌NX -6，其保藏编号为CGMCC No.20114。新型动物双歧杆菌NX -6未灭活与灭活的发酵上清液、菌悬液、细胞破碎物上清液对斑马鱼表现出良好的减缓体重和体长增长、改善体质量指数(BMI)、降低脂肪面积百分比的作用，具有潜在的减肥功效；且均能显著降低斑马鱼高血脂模型体内的甘油三酯(TG )和总胆固醇(TC )，表现出良好的降血脂作用。本发明所述的新型动物双歧杆菌NX -6在制备和/或预防肥胖、高血脂药物方面有巨大的 潜在应用前景。
权利要求书1页 说明书7页序列表2页 附图5页CN 111676175 A 2020.09.18
C N 111676175
A
1.一株动物双歧杆菌Bifidobacterium animalis NX -6，其特征在于，其保藏编号为CGMCC No.20114。
2.权利要求1所述的一株动物双歧杆菌NX -6在制备降脂物中的应用。
3.根据权利要求2所述的一株动物双歧杆菌NX -6在制备降脂物中的应用，其特征在于，所述动物双歧杆菌NX -6为灭活的发酵上清液、菌悬液和细胞破碎物上清液。
4.根据权利要求2所述的一株动物双歧杆菌NX -6在制备降脂物中的应用，其特征在于，所述动物双歧杆菌NX -6为未灭活的发酵上清液、菌悬液和细胞破碎物上清液。
权 利 要 求 书1/1页CN 111676175 A
一株动物双歧杆菌NX-6及其在制备降脂物中的应用
技术领域
[0001]本发明涉及微生物技术领域，更具体的说是涉及一株动物双歧杆菌NX-6 及其在制备降脂物中的应用。
背景技术
[0002]高血脂是一种血脂超出正常水平的亚健康或疾病状态，是导致冠心病、动脉粥样硬化、高血压等心血管疾病的最主要诱因，和肥胖、糖尿病等多种代谢疾病的发病率正相关。从2002年到2012年，血脂异常在成人中的患病率大幅上升，率和控制率低。2013～2014年中国慢性病与危险因素监测调查结果显示，中国≥18岁人血清总胆固醇(TC)、低密度脂蛋白胆固醇 (LDL-C)、甘油三酯(TG)和高密度脂蛋白胆固醇水平(HDL-C)分别为 4.70mmol/L、2.88mmol/L、1.14mmol/L、1.35mmol/L，TC水平较前明显升高。根据国家心血管病中心组织编撰的《中国心血管病报告2018》，我国现在心血管病人数2.9亿，2016年心血管病以40％的死亡率仍居首位，且患病率持续上升。
[0003]美国心脏病学会/美国心脏协会(ACC/AHA)和英国国家健康和保健研究所(NICE)的指南表明，降脂药物对动脉粥样硬化性心血管疾病(ASCVD) 的一级和二级预防有益，他汀类药物的效果最为明显。他汀类药物能将LDL-C 降低到20％到60％，对69511名冠心病患者的全因死亡风险分析发现使用他汀类药物降低胆固醇能使患者死亡风险减少16％。值得提出的是，他汀类药物虽然以良好的耐受度在高血脂、心血管疾病中广泛使用，但会对骨骼肌、代谢、肾脏功能、神经系统等产生副作用，这些副作用在
临床上被统称为他汀相关症状(SAS，statin associated symptoms)。此外，纤维蛋白、胆酸结合剂也能起到良好的降血脂作用，但都有明显的副作用而被限制。烟酸对正常 HDL-C或伴随低HDL-C的高胆固醇血症患者有一定的疗效，但耐受度较低。
[0004]当传统医学的应用受到限制，更多补充或替代的手段就会越来越被需要和认可，目前以益生菌、天然产物、中草药为等主导的新型降血脂疗法因其天然无毒、效果显著、反应温和、来源安全的特点开始被越来越多的医疗学者重视。最早在19世纪70年代，曼恩就发现了发酵奶制品的降脂作用，并认为降血脂的机制是由于醋酸酯(乙酰辅酶A的前体)合成胆固醇被抑制。在这一开创性的研究报道了野生乳酸菌的降胆固醇作用后，大量的研究对乳酸菌的降胆固醇作用进行了研究，特别是乳杆菌和双歧杆菌。但目前国内益生菌的研究还只集中在基础研究，对益生菌降血脂功能的开发力度不够，功能评价路径尚不完善，最终造成我国拥有独立知识产权的优良菌株稀缺，应用在临床上代替或辅助的功能物益生菌更是寥寥无几。基于此，建立科学、完整的功能评价体系，筛选出疗效强、活性好的国产专利药物菌株具有重要的社会价值和研究意义。 [0005]因此，提供一株动物双歧杆菌NX-6及其在制备降脂物中的应用是本领域技术人员亟需解决的问题。
发明内容
[0006]有鉴于此，本发明提供了一株动物双歧杆菌NX-6及其在制备降脂物中的应用。
[0007]为了实现上述目的，本发明采用如下技术方案：
[0008]一株动物双歧杆菌Bifidobacterium animalis NX-6，其保藏编号为CGMCC No.20114，已保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，简称 CGMCC，地址北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，保藏日期为2020年06月19日，分类命名为动物双歧杆菌Bifidobacterium animalis。
[0009]进一步，所述的一株动物双歧杆菌NX-6在制备降脂物中的应用。
[0010]进一步，所述动物双歧杆菌NX-6为灭活的发酵上清液、菌悬液和细胞破碎物上清液。
[0011]进一步，所述动物双歧杆菌NX-6为未灭活的发酵上清液、菌悬液和细胞破碎物上清液。
[0012]本发明所述新型动物双歧杆菌NX-6，在体内对斑马鱼表现出良好的减缓体重和体长增长、改善体质量指数(BMI)、降低脂肪面积百分比的作用，具有潜在的减肥功效；同时该菌株能显著降低斑马鱼高血脂模型体内的甘油三酯(TG)和总胆固醇(TC)，表现出良好的降血脂作用。
[0013]本发明所述新型动物双歧杆菌NX-6在体内具有减肥、降血脂的作用，包括菌株未灭活与灭活的发
酵上清液(胞外分泌物)、菌悬液(菌体)、细胞破碎物上清液(胞内物)。[0014]经由上述的技术方案可知，与现有技术相比，本发明公开提供了一株动物双歧杆菌NX-6及其在制备降脂物中的应用，新型动物双歧杆菌 NX-6是从健康的婴幼儿新鲜粪便中分离得到的，在体内对斑马鱼表现出良好的减缓体重和体长增长、改善体质量指数(BMI)、降低脂肪面积百分比的作用，同时能显著降低斑马鱼高血脂模型体内的TG和TC，具备应用于减肥、调节血脂水平的潜能，此为利用新型动物双歧杆菌NX-6开发预防或心血管疾病、预防肥胖、高血脂的益生菌制剂提供理论参考和指导依据。
附图说明
[0015]为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据提供的附图获得其他的附图。
[0016]图1为本发明新型动物双歧杆菌NX-6的MALDI-TOF MS蛋白指纹图谱；
[0017]图2为本发明新型动物双歧杆菌NX-6形成的菌落形态图；
[0018]图3为本发明新型动物双歧杆菌NX-6革兰氏染后的显微形态观察；
[0019]图4为本发明新型动物双歧杆菌NX-6未灭活与灭活的发酵上清液、菌悬液和细胞破碎物上清液对
斑马鱼体重的影响；
[0020]图5为本发明新型动物双歧杆菌NX-6未灭活与灭活的发酵上清液、菌悬液和细胞破碎物上清液对斑马鱼体长的影响；
[0021]图6为本发明新型动物双歧杆菌NX-6未灭活与灭活的发酵上清液、菌悬液和细胞
破碎物上清液对斑马鱼BMI的影响；
[0022]图7为本发明新型动物双歧杆菌NX-6未灭活与灭活的发酵上清液、菌悬液和细胞破碎物上清液对斑马鱼体内脂肪分布的影响；
[0023]图8为本发明新型动物双歧杆菌NX-6未灭活与灭活的发酵上清液、菌悬液和细胞破碎物上清液对斑马鱼体内脂肪面积百分比的影响；
[0024]图9为本发明新型动物双歧杆菌NX-6未灭活与灭活的发酵上清液、菌悬液和细胞破碎物上清液对斑马鱼高血脂模型体内甘油三酯的影响；
[0025]图10为本发明新型动物双歧杆菌NX-6未灭活与灭活的发酵上清液、菌悬液和细胞破碎物上清液对斑马鱼高血脂模型体内总胆固醇的影响。
具体实施方式
[0026]下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
[0027]实施例1新型动物双歧杆菌NX-6分离、鉴定及保藏
[0028](1)分离：将粪便样本经梯度稀释后，分别接种于BS固体培养基中， 37℃厌氧培养48h-72h，挑取平板上的单菌落划线三代得到纯化后的菌株。将三代划线得到的单克隆接种于BS液体培养基中，37℃厌氧培养12～16h，加入40％甘油，菌液与甘油等体积混合，置于-80℃冰箱中保存。
[0029](2)菌株形态学鉴定：对筛选出的菌株进行酶触试验，观察有无气泡产生。对筛选出的菌株进行革兰氏染后使用油镜镜检，革兰氏阳性呈紫，革兰氏阴性呈红。双歧杆菌可观察到Y型、V型特征。
[0030](3)通过MALDI-TOF MS蛋白指纹图谱对经过形态学鉴定的菌株进行快速质谱鉴定。
[0031](4)菌株的分子生物学鉴定：通过菌落PCR利用16S rDNA通用引物 27F和1492R，对经过质谱鉴定的菌株进行16S rDNA全长片段扩增，对扩增产物进行电泳，得到相应的条带后将扩增产物送往外包公司测序，并将测序结果与NCBI上的标准菌种序列进行比对鉴定。[0032]27F：5’-AGAGTTTGATCCT
GGCTCAG-3’；SEQ ID NO.1；
[0033]1492R：5’-GGTTACCTTGTTACGACTT-3’；SEQ ID NO.2。
[0034]实验结果：从广东省广州市婴幼儿新鲜粪便中筛选出的菌株，经形态观察、MALDI-TOF MS蛋白指纹图谱和16S rDNA鉴定，其中菌株NX-6被鉴定为动物双歧杆菌，其16S rDNA 序列如SEQ ID NO.3所示；MALDI-TOF MS 蛋白指纹图谱如图1所示。
[0035]TCTACTTAGACGGCTCCCCCCACAAGGGTCGGGCCACCGGCTTCGG GTGCTACCCACTTTCATGACT TGACGGGCGGTGTGTACAAGGCCCGGG AACGCATTCACCGCGGCGTTGCTGATCCGCGATTACTAGCGACTCCGCC TTCACGCAGTCGAGTTGCAGACTGCGATCCGAACTGAGACCGGTTTTCA GCGATCCGCCCCACGTCACCGTGTCG CACCGCGTTGTACCGGCCATTGT AGCATGCGTGAAGCCCTGGACGTAAGGGGCATGATGATCTGACGTCAT CCC CACCTTCCTCCGAGTTGACCCCGGCGGTCCCACATGAGTTCCCGGC ATCACCCGCTGGCAACATGCGGCGAGGGT TGCGCTCGTTGCGGGACTT AACCCAACATCTCACGACACGAGCTGACGACGACCATGCACCACCTGT GAACCGG
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